BluenativePAGE試驗(yàn)講義

1、BlueNativePAGE一.實(shí)驗(yàn)原理:BlueNativePAGE(BN-PAGE是HermannSchagger1991年創(chuàng)立的一種從生物樣品(質(zhì)膜，胞漿等)中分離蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。能分離10KD-10MKD范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)復(fù)合物。BN-PAGE以考馬斯亮藍(lán)G-250代替SDS使蛋白質(zhì)復(fù)合物帶負(fù)電荷，根據(jù)各個不同復(fù)合物分子量不同從而在膠中得到分離。這些復(fù)合物在膠中以藍(lán)色條帶形式呈現(xiàn)。樣品用一些溫和的去污齊如dodecylmaltoside(DM),TritonX-100和毛地黃皂昔(digitonin)等溶解，從而使復(fù)合物以近似天然的狀態(tài)分離。實(shí)驗(yàn)中若想進(jìn)一步分析復(fù)合物各個

2、亞基的成分，通常采用BN-PAGE合SDS-PAGE方式.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖所示。-PO-III10.0002.500kDa1.000700490aoo130!/IIIVBN-WGEO二實(shí)驗(yàn)需要用到的試劑：咪口坐(Imidazole),6-氨基乙酸(6-Aminohexanoicacid),聚丙烯酰胺(Acrylamide(twice-crystallized),甲叉雙丙烯酰胺.(Bis-acrylamide(twice-crystallized),20%(W/V)TritonX-100,20%(W/功dodecylmaltoside(DM),20%(WN)digitonin,甘油，5%(W/V)

3、G-250(CoomassieblueG-250),前基乙醇(.Mercaptoethano)，過硫酸俊(AP),TEMED氯化鈉三溶液的配置AB-3mix:稱48gacrylamide加入大約50mL的ddH2O中，攪勻后定容至100mL,再加入1.5gbisacrylamide,混勻，三層濾紙過濾后置于棕色瓶中保存。5%G-250容液：0.5gG-250,0.6559g6-氨基乙酸溶于10毫升水中電極緩沖液和凝膠緩沖液的配方見表TABLE1|ElectrodeandgelbuffersforBN-PAGEHCathodebufferBCathodebufferH/10Anodebuffer

4、Geibuffer(3x)Tricine(mM)5050-Imidazole(mH)7.57.52575CMTTiassieblueG-250(%)0.020.002-6-Aminohexanoicarid(M)一-一1.5pH*7,0*7"九0b7。樣品溶解液的配方見表2TABLE2|SoLubilizarionbuffersforBN-PAGE.SolubilizationbufferASolubiLizationbufferBSodiumchlorklemM)50一Imidazole/HCl(mM)50506-Aminohexanoicacid(mM)2500EDTA(mM)1

5、1pH(at4JC)7.07,0分離膠和濃縮膠的配方見表3TABLE3|CompasitionofasampiegelandandIT/；：acrylamidemirtuiEstopreparemacrylamidegrsdientgel.SamplegelGradientsepaRtiongel3.5%acrtamide4%acrytamide13%mw加mi加AB-3mix0.44ml1.5ml3.9mlGelbuffer2ml6ml5mlGlycerol3g,Vater3.4ml10.4mL3ndTotalvolume6ml18ml15ml10%APS50pl100lil75plTEME

6、D5W10pl7.5iA四實(shí)驗(yàn)流程：1.灌膠選擇合適的玻璃板，用洗滌劑反復(fù)擦洗玻璃板，再用自來水反復(fù)沖洗，最后用雙蒸水漂洗，自然晾干或者用吹風(fēng)機(jī)吹干。隔條以同樣的方法洗干凈以后，自然晾干或用濾紙吸干。將玻璃板卡入隔條中，短板對負(fù)極置于電泳槽中，用1%勺瓊脂糖封膠。將電泳槽放在4度冰箱中冷卻。按照表上所列的方法配好不同濃度的分離膠，用梯度混合儀灌膠。灌完膠后，用水飽和的正丁醇封住膠面，等待凝膠聚合。大約30分鐘后，凝膠的表面出現(xiàn)兩個界面，分離膠已經(jīng)聚合，去掉表面的正丁醇層和水層，再用雙蒸水沖洗膠面，直到?jīng)]有正丁醇的味道為止。用濾紙小心的吸干膠面。按照表中的方法配好濃縮膠，灌膠，插入梳子，等待凝膠

7、聚合。2樣品處理不同的樣品有不同的處理方法。現(xiàn)在以海馬突觸質(zhì)膜為例講解樣品處理方法。從-20度冰箱里取出一管用1.5mLEPf裝著的海馬突觸質(zhì)膜樣品，置于37度水浴鍋中使其快速溶解。溶解后加入表二所示的solutionbufferA溶液，加到EPf最大刻度處。18000g冷凍離心20分鐘，棄上清，取沉淀。稱沉淀的重量。按照detergent/protein=3:1的比例加入20%TritonX-100溶液，使TritonX-100的終濃度為2%用Tip頭小心混勻樣品，注意不能有氣泡，冰上裂解30分鐘。然后18000g冷凍離心20分鐘，收集上清，測蛋白含量。取出120微克的樣品，加入3微升5%G

8、-250溶液和5微升50%的甘油，混勻后即可上樣。所有操作均在冰上進(jìn)行。3電泳將處理好的樣品用微量進(jìn)樣器點(diǎn)在上樣孔中以后，倒入1x負(fù)極液和正極液，插好電源，以恒壓100V開始電泳，待樣品跑過濃縮膠后，電壓改為250V,之后可以慢慢增大，到樣品最后跑完。只要控制電流在50毫安以內(nèi)即可。待樣品跑到凝膠的1/3處更換負(fù)極液，將原來1x負(fù)極液換成1/10x,這樣可以降低膠的背景。負(fù)極液的配方見表一。電泳過程如下圖所示：BeforeDuringAfter4固定和染色當(dāng)樣品跑完整個凝膠后，剝膠，固定和染色。這個過程和普通的SDS交一樣。即用固定液（50%ddH2O,40%甲醇，10%乙酸）固定30分鐘后，

9、水洗4次，15分鐘一次。然后在考染液中染色過夜。5脫色，掃描染色過夜后，倒掉考染液，用雙蒸水脫色，到背景十分干凈為止，掃描。如果不要分析復(fù)合物各個亞基的組分，就可以直接拿BlueNative膠切膠，酶解后質(zhì)譜鑒定。若還想進(jìn)一步分析復(fù)合物各個亞基的組成，則還要做二向SDS-PAGE五二向SDS-PAGE作過程1灌膠選擇合適的玻璃板，洗干凈后按照上述方法灌膠。SDS-PAGE30凝膠儲液，分離膠buffer,濃縮膠buffer的配制見實(shí)驗(yàn)室自編教材蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)實(shí)踐指南，凝膠濃度根據(jù)樣品特性選擇合適的濃度，凝膠濃度與其對應(yīng)的分離范圍見表3.1。表31凝膠濃度與其對應(yīng)的分離范圉本實(shí)驗(yàn)室常用的分離

10、膠的濃度為11.5%,濃縮膠的濃度為4.8%,配方如下:膠法度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-20010%14-20012.5%14-10015%14-6011.5%分離膠4.8%濃縮膠30%!膠儲液5.750.8分離膠bufferP3.75濃縮膠膠buffer1.25雙蒸水5.5毫升2.95AP140微升20微升TEMED10微升5微升電極緩沖液的配置：Tris(MW121.14)3.03g,甘氨酸(MW75.0714.4g,SDS1g,加雙蒸水至1000ml2平衡將BlueNative膠根據(jù)條帶的位置切成長條，置于含有1%SDS1海基乙醇溶?中平衡2小時，水洗20分鐘。3轉(zhuǎn)移

11、先煮瓊脂糖(0.05g瓊脂糖，10毫升電極緩沖液，30微升澳酚藍(lán))，然后將平衡好的膠條擺在二向SDS膠的濃縮膠膠面上，用壓膠片把膠條壓緊，使二者緊密結(jié)合，并保證兩個膠面之間沒有氣泡，再向膠面上封一層瓊脂糖。4跑膠等瓊脂糖凝固后，將玻璃板擺到電泳槽上，倒入電極緩沖液，以25毫安恒流開始電泳。等樣品跑過濃縮膠后，將電流改為45毫安直到電泳結(jié)束。5銀染固定液（100毫升乙醇，25毫升乙酸，125毫升雙蒸水）固定30分鐘將固定液倒掉，加入敏化液（0.5g硫代硫酸鈉，17乙酸鈉，75毫升乙醇，最后定容至250毫升）敏化30分鐘倒掉敏化液，加入雙蒸水洗3次，每次5分鐘倒掉水，加入銀染液（0.625g硝酸銀

12、加水至250毫升）染色20分鐘倒掉染色液，水洗兩次，每次1分鐘倒掉水，加入顯影液（6.25g碳酸鈉，50微升甲醛溶于250毫升水中），3-5分鐘以后即可看到結(jié)果倒掉顯影液，快速加入終止液（3.65gEDTA溶于250毫升水中）終止20分鐘倒掉終止液，加入雙蒸水洗膠面注意：每步之間都要換干凈手套，銀染液配好后要避光。6掃描Tips:1樣品處理是整個實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，樣品處理最重要的是去污劑的濃度以及去污劑和蛋白的比例，這個通常需要摸索，設(shè)置不同的濃度以及比例，最后選擇最佳的。下圖就是一個例子。ADigitonin(mM)g6-bM(eM)toolowrighttoohightoolowrrghttooDigit4nin(mM)£)B-DW(eM)toolowrightt