抗鏈霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立及其免疫學(xué)特性鑒定

1、文章編號(hào):100028551(2007052506204抗鏈霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立及其免疫學(xué)特性鑒定范國(guó)英1王建華1鐘華2楊艷艷3鄧潤(rùn)廣3張改平3(11西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊陵712100;21河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003;31河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所,河南鄭州450002摘要:用E DC 一步法和戊二醛法將S M 偶聯(lián)于載體蛋白牛血清白蛋白(BS A 和OVA ,合成免疫原BS A 2S M 和包被原OVA 2S M 。用紫外線掃描、S DS 2PAGE 進(jìn)行鑒定;用BS A 2S M 免疫BA LB C 小鼠,用雜交瘤技術(shù)建立分泌S M mAb 的細(xì)

2、胞株3F92C4;對(duì)S M mAb 的效價(jià)、親和性、敏感性和特異性等免疫學(xué)特性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,BS A 2S M 人工抗原分子結(jié)合比為125;篩選出3F92C4敏感特異的雜交瘤細(xì)胞1株,間接E LIS A 測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清,效價(jià)為1312102,同種型為IgG 2a ;腹水的親和常數(shù)(K a 為8141011L m ol ;IC 50為8199g L ,與雙氫鏈霉素交叉反應(yīng)為10916%,與其他S M 結(jié)構(gòu)相似物和功能近似物無(wú)交叉反應(yīng)性。本試驗(yàn)獲得了抗S M 高價(jià)、敏感、特異的mAb ,可用于S M 的殘留檢測(cè)。關(guān)鍵詞:鏈霉素;單克隆抗體;免疫學(xué)特性GENERATION AN D IMMU

3、N OLOGICA L TRAIT OF MON OC LONA L ANTIBODY FOR STREPTOMYCINFAN G uo 2ying 1W ANGJian 2hua 1ZH ONG Hua 2Y ANG Y an 2yan 3DE NG Run 2guang 3ZH ANG G ai 2ping3(11The Animal Science and technology College ,Northwest Sci 2Tech University o f Agriculture and Forestry ,Yangling ,Shaanxi 712100;21The Anima

4、l Science College ,H enan Institute o f Science and Technology ,Xinxiang ,H enan 453003;31Institute o f Biology and Technique Science ,Agricultural Academy o f H enan Province ,Zhengzhou ,H enan 450002Abstract :The coating antigen OVA 2S M and immunogen BS A 2S M synthesized with S M was coupled wit

5、h BS A and OVA by E DC 2method and glutaraldehyde method.Ultraviolet and S DS 2PAGE were used to identify S M artificial antigen.BA LB C mice were immunized by BS A 2S M ,the hybridoma lines that secrete S M mAb were established by using m onoclonal antibody hybridoma technology.The immunological tr

6、aits such as titer ,affinity ,sensitivity and specificity of this mAb were characterized.The results showed that the conjugation ratio of S M to BS A in S M artificial antigen was about 251.The titer ofsupernatant hybridoma cell lines of 3F92C4was 1312102by indirect E LIS A.The is otypes in ascites

7、was IgG 2a ,the affinity constant (K a was 8141011L m ol ,IC50was 8199g L ,cross 2reactivity to dihydrostreptomycin was 10916%andlittle cross 2reactivity to other com pounds.The experiment generated S M mAb was high 2titer ,sensitivity and specificity.And this mAb can be used to detecte S M residues

8、 in food.K ey w ords :streptomycin ;m onoclonal antibody ;immunological traits收稿日期:2006211215基金項(xiàng)目:“十五”國(guó)家重大科技專項(xiàng)(001BA804A30鏈霉素(S M 屬于氨基糖苷類抗生素,用于革蘭氏陰性菌和結(jié)核桿菌感染治療,在治療家畜感染性疾病中發(fā)揮了重要作用,但其毒副作用較大1。1999年農(nóng)業(yè)部在動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量中規(guī)定,牛奶中鏈霉素的最高殘留限量(MR L 為200g kg 2。然而,相應(yīng)的鏈霉素檢測(cè)技術(shù)并不完備,由于氨基糖苷抗605核農(nóng)學(xué)報(bào)2007,21(5:506509Journal

9、 o f Nuclear Agricultural Sciences生素缺少發(fā)色基團(tuán),應(yīng)用HP LC分析時(shí)常要對(duì)其衍生化,設(shè)備條件過(guò)高,難以普及;并且其理化測(cè)定方法相當(dāng)復(fù)雜、通用性差3。免疫學(xué)分析方法具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),已在獸藥、農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用4。本研究旨在為鏈霉素殘留免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立和擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)檢測(cè)產(chǎn)品技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。1材料與方法111試驗(yàn)材料SPF級(jí)6周BA LBC小鼠,購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS0由英國(guó)國(guó)家動(dòng)物健康研究院惠贈(zèng)。S M、牛血清白蛋白(BS A、卵清蛋白(OVA、12乙基232(32二甲基氨基

10、丙基碳化二亞胺鹽酸鹽(E DC、O2羧甲基羥胺、戊二醛(G A、弗氏完全佐劑(FC A、弗氏不完全佐劑(FI A等化學(xué)試劑均為Sigma產(chǎn)品,純度9910%;羊抗鼠酶標(biāo)二抗(G aMIgG2HRP由本實(shí)驗(yàn)室制備;3,3,5,52四甲基聯(lián)苯胺(T M B購(gòu)自上海華美;其他試劑市售所得,均為AR級(jí);試驗(yàn)用水為超純水。準(zhǔn)確配制1gL的S M母液(1g S M溶于1L雙蒸水中,根據(jù)需要配制標(biāo)準(zhǔn)液;洗液(P BST為含體積比0105%T ween220的P BS液;包被液(C BS為011m olL pH916的碳酸鹽緩沖液;阻斷E LIS A的封閉液、稀釋液為含體積比5%豬血清的P BST;酶底物為T

11、 M B的磷酸2檸檬酸緩沖液;終止液為2m olL硫酸。112人工抗原的合成與鑒定11211人工抗原的合成采用E DC一步法合成人工抗原。第1步,與O2羧甲基羥胺在pH9的條件下反應(yīng),引入羧基;第2步,用E DC一步法將S M偶聯(lián)到載體蛋白BS A和OVA上。反應(yīng)液用葡聚糖凝膠Sephadex G225柱純化,用T LC監(jiān)測(cè),收集R f=0112組分,制得人工抗原BS A2S M,凍干,4保存?zhèn)溆?。同樣方法制得包被抗原OVA2E DC2S M。為消除橋抗對(duì)單克隆細(xì)胞篩選的影響,同時(shí)用戊二醛(G A方法制備包被原S M2G A2OVA。11212人工抗原的鑒定(1UV鑒定:用P BS配制S M和

12、BS A標(biāo)準(zhǔn)溶液,取一定量的BS A2S M溶于P BS,用Braford法5測(cè)定其蛋白質(zhì)的濃度,據(jù)此濃度調(diào)節(jié)BS A2 S M溶液中蛋白質(zhì)的濃度,使之與BS A標(biāo)準(zhǔn)溶液一致,在波長(zhǎng)200400nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外線掃描,參照楊利國(guó)等6方法計(jì)算BS A與S M的分子結(jié)合比。(2S DS2 PAGE鑒定:參照K amm ps等7的方法。113細(xì)胞融合用小鼠的篩選用BS A2S M免疫6周齡BA LBC小鼠5只,劑量20g200l只,背部皮下分點(diǎn)注射。首免,用無(wú)菌P BS 溶解BS A2S M,與等量FC A混合,充分乳化;加強(qiáng)免疫,用無(wú)菌P BS溶解BS A2S M,與等量FI A混合,充分乳化,

13、首免后4周進(jìn)行,共免5次,每次間隔26周,最后1次免疫后10d斷尾采血分離血清,用間接E LIS A檢測(cè)抗S M抗體效價(jià),若效價(jià)100010001000100010001000100010001000100010001000010013討論完全抗原的制備是建立小分子免疫學(xué)分析方法的基礎(chǔ),S M是小分子化合物,分子量M N=581126,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,不具備免疫原性,根據(jù)Landsteiner9創(chuàng)立的小分子半抗原免疫學(xué)理論,半抗原設(shè)計(jì)遵循不產(chǎn)生新的抗原決定簇、間隔臂性質(zhì)穩(wěn)定且長(zhǎng)度適宜、化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單易行三個(gè)原則,選擇S M上的醛基作為偶聯(lián)位點(diǎn),用羧甲基羥胺引入羧基,再與載體蛋白上的氨基偶聯(lián),偶聯(lián)率較高

14、,免疫原性較好。Sion f等10認(rèn)為,一定長(zhǎng)度的間隔臂的介入,有助于半抗原結(jié)構(gòu)的暴露和特異性抗體的產(chǎn)生,但是間隔臂過(guò)長(zhǎng)可形成新的抗原表位,易被細(xì)胞識(shí)別而產(chǎn)生“橋抗體”,間隔臂過(guò)短則載體蛋白的空間位阻將影響細(xì)胞805核農(nóng)學(xué)報(bào)21卷對(duì)半抗原的識(shí)別,不產(chǎn)生特異性抗體,最好的間隔臂是36個(gè)直鏈碳,長(zhǎng)度以58!為宜。本試驗(yàn)以N CH 3COO 作間隔臂,長(zhǎng)度適宜,產(chǎn)生了針對(duì)S M 的特異性抗體。關(guān)于半抗原與載體蛋白的最佳分子結(jié)合比目前尚未形成定論,Eilange 11提出最佳分子結(jié)合比為5251,Schneider 等12提出以10201為好,吳松如等13認(rèn)為以3451為好。本試驗(yàn)S M 與BS A

15、的分子結(jié)合比為25:1,并取得了較好的免疫效果。間隔臂抗體的產(chǎn)生是不可避免的。故在制作多抗時(shí),會(huì)產(chǎn)生不能抑制或抑制限較高,即使在選用不同的包被原時(shí),亦不能產(chǎn)生很好的結(jié)果。故在篩選單抗時(shí),合理篩選程序決定了能否成功地獲得1株高親和力的單抗。本試驗(yàn)采用三種方法同時(shí)檢測(cè),第一步,用與免疫原合成完全相同的方法合成的包被原進(jìn)行篩選,即可獲得目的半抗原抗體和間隔臂抗體;第二步,用與免疫原不同的合成方法,即對(duì)間隔臂不同的包被原進(jìn)行篩選,獲得的陽(yáng)性孔即為目的半抗原的抗體;第三步,同時(shí)用兩種方法合成的包被原包被作抑制試驗(yàn),抑制限較低的陽(yáng)性孔即可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),凍存及亞克隆。本試驗(yàn)成功合成了S M 人工抗原,經(jīng)4次

16、免疫BA LB C 小鼠后獲得了高效價(jià)的pAb ,通過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得1株高親和力和高特異性的雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)多次傳代、凍存與復(fù)蘇,雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定,經(jīng)鑒定制備出的S M mAb 高價(jià)、敏感、特異,可以用于S M 殘留檢測(cè)的免疫學(xué)試驗(yàn)。參考文獻(xiàn):社,1997,736737版社,2002,3443503van Bruijnsv oort M ,Ottink S J ,et al.Determination of streptomycin anddihydrostreptomycin in milk and honey by liquid chromatography with tandem mas

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