流式細胞儀常用技術(shù)方法)

1、流式細胞儀常用技術(shù)方法細胞周期/DNA分析(PI法一、鞘液準備(至少3L PBS,提前一天準備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細胞(制備過程如下,僅不加抗體三、實驗步驟1.取對數(shù)期生長細胞,倒去培養(yǎng)液,胰酶適度消化細胞,用培養(yǎng)液吹打,1000rpm,離心10min棄上清;2.PBS洗2次,加0.5ml吹勻,務(wù)必吹散;3

2、.加入70%預(yù)冷乙醇中(標準做法是將細胞懸液加入預(yù)冷70%酒精,固定時可加入Triton X-100以增加膜的通透性封口膜封口,4固定1-2h或過夜(可長至一個月;4.1000rpm×10min離心收集細胞,PBS洗兩次;6.加入Rnase-A約3ul至終濃度50ug/ml,37水浴消化30min;7.加入PI約50ul至終濃度約為5-50ug/ml,室溫避光染色30min;8.用300目濾網(wǎng)過濾,上機檢測。細胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit一、鞘液準備(至少3L PBS,提前一天準備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水

3、中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細胞(制備過程如下1-6三、若做DNA倍體分析,需另設(shè)附加對照管腫瘤細胞和外周血單核細胞的混合管,比例至少為2:1四、實驗步驟1. 將細胞消化后,用冷PBS洗細胞兩次,300g×5min(若細胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到500g,為減少細胞損失可用1.5ml離心管離心;2. 棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細胞團,加入1m

4、l Buffer Solution并低速混勻細胞。3. 室溫離心,300g×5min;4. 重復(fù)2、3一次;5. 棄上清留大約50ul下面的液體,加入1ml Buffer Solution 重懸細胞;6. 計數(shù)細胞,用Buffer Solution將細胞密度調(diào)為1×106個/ml;7. 染色:B.每管加入250ul Solution A,用手輕拍混勻(勿用漩渦混勻;C.室溫反應(yīng)10min,保留Solution A;D.加入200ul Solution B,輕輕混勻;E.室溫反應(yīng)10min,保留Solution A+B;F.加入200ul冷Solution C,輕輕混勻,黑暗

5、處2-8孵育10min;用50um尼龍網(wǎng)過濾細胞,加入上樣管上流式分析(3h內(nèi)分析完。淋巴細胞亞群分析一、鞘液準備(至少3L PBS,提前一天準備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細胞(制備過程如下,僅不加抗體三、實驗步驟1.采集血液樣品,取100ul抗凝全血加入每支試管中,注意不要碰到管壁。2.輕輕混勻,依次加入20u

6、l Isotype Control(如沒有的話用沒染色細胞代替,另外幾管加入20l熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。3.加入1×紅細胞溶解液450l,渦旋混勻避光保存10min,待管內(nèi)液體透亮,300-500g離心5min,去上清4.加PBS 2mlPBS渦旋混勻,300-500g離心5min,棄上清,然后加0.5mlPBS搖勻。過300目尼龍網(wǎng),4避光1h內(nèi)上機檢測;若不能及時上機,加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS,放4冰箱保存, 48h內(nèi)上機檢測。Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡(BD公司Annexin-FITC/PI試劑盒細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面,目前早期

7、識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面,在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所獨特的,也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其

8、早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。一、鞘液準備(至少3L PBS,提前一天準備0.01M 的 PBS 配制方法： 800ml 蒸餾水中溶解 NaCl8.0g； KCl0.2g； Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié) pH 到 7.2-7.4（用 HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)，各地蒸 餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至 1L，0.22um 濾膜過濾后，室溫 保存。 二、制備三個質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細胞儀的熒光補償和設(shè)置十字門 的范圍（可選）： a 沒有染色的細胞; b 僅用熒光標記的 a

9、nnexin V 染色的細胞; （細胞先誘導(dǎo)凋亡：42 水浴 10min） c 僅用 PI 染色的細胞. （一半活細胞一半乙醇固定的細胞） 三、實驗步驟 1.細胞收集：懸浮細胞直接收集到 10ml 的離心管中，1000r/min 離心 8min，收集到 1.5ml 離心管，用冷 PBS 洗細胞兩次，1000r/min 離 心 8min，然后用 1×bind buffer 重懸細胞，配成樣本細胞數(shù)為（15） ×106 個/mL。 2.用 100ul 細胞懸液（1×105 個 cell）到離心管中。 3.加入 5ulAnnexin V-FITC 和 5ulPI，混勻細

10、胞，室溫下避光孵育 15min。 4.加入 400ul 1×bind buffer 每管， 用流式細胞儀分析， 一小時內(nèi)完成。 結(jié)果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染 性， 壞死細胞則不能。 細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅 色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細 胞凋亡的早期 PI 不會著染而沒有紅色熒光信號。 正常活細胞與此相似。 在雙變量流式細胞儀的散點圖上， 左下象限顯示活細胞，（FITC-/PI-） 為 ； 右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+），也有認為是晚 期凋亡細胞（認為左上象限為壞

11、死細胞 FITC-/PI+）；而右下象限為凋 亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。 Caspase-3-FITC 檢測細胞凋亡 （BD 公司 FITC-CONJUGATED MONOCLONAL ACTIVE CASPASE-3 ANTIBODY APOPTOSIS KIT I） 一、鞘液準備（至少 3L PBS，提前一天準備） 0.01M 的 PBS 配制方法： 800ml 蒸餾水中溶解 NaCl8.0g； KCl0.2g； Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié) pH 到 7.2-7.4（用 HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)，各地蒸 餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至 1L，0.22um 濾膜過濾后，室溫 保存。 二、制備一個陰性對照來設(shè)定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范 圍： 沒有染色的細胞（制備過程如下，僅不加抗體） 三、實驗步驟 1. 將細胞消化后，用冷 PBS 洗細胞兩次，1000rpm×8min（若 細胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到 1500 rpm），用 cytofix/cytopermtm solution 重懸細胞，將細胞密度調(diào)整為 1×106 個/0.5ml； 2. 3. 洗兩次； 4. 計數(shù)總細胞數(shù)，按 1×106 個細胞加入 100ul Perm/wash TM 冰上孵育細胞 20min； 吹吸細胞， 離心， 棄上清， 室溫用 Perm/