變性梯度凝膠電泳技術(shù)的應(yīng)用VIP

1、變性梯度凝膠電泳技術(shù)在廢水生物處理領(lǐng)域中的應(yīng)用*汪文斌第一作者：汪文斌，男，1980年生，本科，工程師，主要從事環(huán)境影響評(píng)價(jià)和工業(yè)廢水處理設(shè)計(jì)。#通訊作者。*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No.30470039)；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目 (No.)。 鄭 昱2 朱 亮3#（1.湖州市環(huán)境科學(xué)研究所，浙江 湖州 313000；2.湖州市能源監(jiān)察支隊(duì)，浙江 湖州 313000；3.浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 310029）摘要 變性梯度凝膠電泳(DGGE)具有可靠性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作便捷等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物領(lǐng)域群落結(jié)構(gòu)多樣性、動(dòng)態(tài)分析以及功能菌群檢測等領(lǐng)域。鑒于生

2、物處理是目前廢水處理處置中的主體工藝，通過DGGE技術(shù)研究來分析廢水生物處理系統(tǒng)中的微生物種群多樣性與群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演替，可對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)起到最優(yōu)化設(shè)計(jì)與工程調(diào)控的指導(dǎo)作用。綜述了DGGE技術(shù)在廢水生物處理領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，并探討了該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在的問題及其發(fā)展前景。關(guān)鍵詞 變性梯度凝膠電泳 廢水生物處理 微生物群落結(jié)構(gòu)Application of DGGE in biological degradation for wastewater treatment Wang Wenbin1，Zheng Yu2，Zhu Liang3 (1.Environmental Science Resea

3、rch Institute, Huzhou Zhejiang 313000；2.Energy Sources Supervision Detachment, Huzhou Zhejiang 313000；3. College of environmental and resource sciences of Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310029)Abstract: Biological degradation is the important process in wastewater treatment. According to den

4、aturing of gradient gel electrophoresis (DGGE) analyzing of genetic diversity and monitoring the dynamic of microbial community, the proper wastewater treatment processes can be designed and controlled. The application of DGGE in study on biological degradation for wastewater treatment was strengthe

5、ned. In application in microbial ecology, the problems and progresses of the technology were discussed.Keywords: denaturing of gradient gel electrophoresis (DGGE)；biological wastewater treatment；microbial community生物處理是目前廢水處理處置中的主體工藝，具有運(yùn)行成本低、操作簡便、出水水質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)廢水和城市污水的處理中。然而，廢水生物處理工藝仍存在污泥膨脹、難降解有

6、毒污染物導(dǎo)致處理系統(tǒng)崩潰、運(yùn)行容易失穩(wěn)等問題，因此深入了解廢水生物處理系統(tǒng)主體活性污泥及生物膜等的微生物生態(tài)系統(tǒng)的區(qū)系組成、動(dòng)態(tài)變化以及功能菌群，解析群落結(jié)構(gòu)、功能菌群豐度與系統(tǒng)運(yùn)行性能之間的關(guān)系，已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究新熱點(diǎn)1，2。微生物分離培養(yǎng)和顯微鏡技術(shù)等傳統(tǒng)微生物學(xué)方法，在研究復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)過程中存在很大的局限性，不能全面、準(zhǔn)確地表征微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)以及菌群演替等生態(tài)特性；而DNA指紋圖譜，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）3、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）3、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)（SSCP）4、末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）5、擴(kuò)增核糖體DNA限制性酶切片段分析（ARDRA

7、）6等分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，大大拓寬了微生物分子生態(tài)學(xué)的研究視野，將廢水生物處理領(lǐng)域的研究帶入了一個(gè)革命性的新時(shí)代。近年來，DGGE技術(shù)因其可靠性高、分析速度快、操作簡單等特點(diǎn)，廣泛用于分析活性污泥、生物膜的微生物遺傳多樣性以及群落動(dòng)態(tài)演替。本文在簡述DGGE技術(shù)基本原理的基礎(chǔ)上，對(duì)該技術(shù)在廢水生物處理領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)行了綜述。1 DGGE技術(shù)原理DGGE是由FISCHER和LERMAN創(chuàng)立的用于DNA突變檢測的一種電泳技術(shù)，其原理是基于不同序列的DNA片段具有不同的雙螺旋解鏈溫度（Tm），DNA在變性劑濃度呈線性梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳到與Tm值相對(duì)應(yīng)的變性劑濃度點(diǎn)時(shí)，雙鏈DNA分子解旋變

8、性導(dǎo)致電泳速度急劇下降，最終停留在凝膠中其相應(yīng)的變性劑濃度位置，形成分散的條帶。該技術(shù)可分辨具有相同或相近分子量的DNA片段序列差異，可達(dá)到一個(gè)核苷酸水平的突變檢出率7。通常，DGGE分為垂直和水平兩種電泳形式。垂直電泳是指變性劑梯度方向與電泳方向垂直，主要用于確定DNA片段分離的最佳變性劑梯度范圍；水平電泳的變性劑梯度方向與電泳方向平行，根據(jù)垂直電泳確定的范圍可進(jìn)行多個(gè)樣品的同時(shí)分析。DGGE技術(shù)主要步驟如下：總DNA提取及純化；目標(biāo)DNA片段PCR擴(kuò)增；確定最佳變性劑梯度范圍、電泳時(shí)間和溫度8；PCR產(chǎn)物DGGE分析。2 DGGE在廢水生物處理微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展1993年，MUY

9、ER等9率先報(bào)道將DGGE技術(shù)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究，此后十多年，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物分子生態(tài)學(xué)的研究，筆者就其在廢水生物處理領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行簡要介紹。2.1 污泥種群多樣性分析目前，DGGE技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)或者特異種群多樣性分析。LAPARA等10采用DGGE技術(shù)對(duì)七段法（4個(gè)高溫處理過程和3個(gè)中溫處理過程）生物處理制藥廢水過程微生物種群多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，中溫池污泥樣品的指紋圖譜條帶豐度要明顯高于高溫池內(nèi)的污泥樣品，表明反應(yīng)體系溫度的升高會(huì)減少微生物多樣性。KASONEN等11對(duì)處理含硫酸鹽廢水流化床反應(yīng)器（FBR）內(nèi)不同基質(zhì)條件下的污泥微生物群落結(jié)構(gòu)D

10、GGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，以乳酸為電子供體的FBR內(nèi)污泥菌群結(jié)構(gòu)要比以乙醇為電子供體更為復(fù)雜。DAR等12應(yīng)用嵌套式PCRDGGE技術(shù)分析活性污泥中硫酸鹽還原菌（SRB）多樣性發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)可檢測豐度較低的功能菌群，使其在環(huán)境樣品分子生態(tài)監(jiān)測中更具有實(shí)際意義。BOON等13采用嵌套式PCRDGGE分析不同廢水處理廠活性污泥菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，活性污泥形態(tài)與易引起泡沫和污泥膨脹的Actinomycetes、氨氧化菌（AOB）及Acidobacterium等菌群的豐度差異和群落組成具有相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上，對(duì)DGGE圖譜的目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠、回收、克隆測序可以獲得更多基因水平上的遺傳信息以進(jìn)行開展系統(tǒng)發(fā)育分析，所測

11、得的序列信息可設(shè)計(jì)寡核苷酸探針來進(jìn)一步研究功能菌群空間結(jié)構(gòu)。FANG等14首次對(duì)產(chǎn)酸反應(yīng)器中的產(chǎn)氫顆粒污泥（HPG）進(jìn)行DGGE圖譜分析，發(fā)現(xiàn)HPG內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)較為單一，基本以低G+C革蘭氏陽性菌為主，包括Clostridium、Bacillus、Staphylococcus、Papillibacter cinnamivorans等。ZEIN等15研究生物濃縮反應(yīng)器(BCR)處理含甲基叔丁基醚(MtBE)廢水過程發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)器內(nèi)微生物種群多樣性較豐富，包括-、-、-及-Proteobacteria等菌群，優(yōu)勢菌為Hyphomicrobium、 Methylobacterium、Sphingomo

12、nas、Pseudomonas和Halomonas等，復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)保證了反應(yīng)器穩(wěn)定的污染物降解效率。JIANG等16應(yīng)用DGGE研究發(fā)現(xiàn)，降解苯酚的活性污泥和顆粒污泥的群落結(jié)構(gòu)相似性較低，共分離到10類苯酚降解優(yōu)勢菌，分屬-、- Proteobacteria和高G+C革蘭氏陽性菌。JIANG等17應(yīng)用FISH技術(shù)分析降解苯酚好氧顆粒污泥內(nèi)PG-01菌株空間分布，以FITC標(biāo)記EUB338、TRITC標(biāo)記ARCH915和Cy5標(biāo)記Pand822為探針，結(jié)果表明，細(xì)菌分布在整個(gè)顆粒區(qū)域，未檢出古細(xì)菌，PG-01菌株主要分布在顆粒外表層。2.2 微生物菌群結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演替多個(gè)樣品的同步分析是DG

13、GE技術(shù)應(yīng)用于微生物分子生態(tài)研究的一大優(yōu)勢，有助于快速監(jiān)測反應(yīng)器啟動(dòng)過程污泥微生物微觀生境變化，及時(shí)分析菌群結(jié)構(gòu)隨時(shí)間（季節(jié)）變化、環(huán)境因子影響等導(dǎo)致的動(dòng)態(tài)演替。BOON等18應(yīng)用DGGE技術(shù)監(jiān)測了兩組生物反應(yīng)器內(nèi)活性污泥在氯苯胺沖擊負(fù)荷下的微生物相動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種有3-CA降解菌的生物強(qiáng)化反應(yīng)器內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，氨氧化菌的活性、豐度至第4天即開始恢復(fù)，而對(duì)照反應(yīng)器內(nèi)至第12天仍未見任何恢復(fù)跡象。LIU等19研究發(fā)現(xiàn)兩相厭氧產(chǎn)酸反應(yīng)器啟動(dòng)后pH急劇下降，并伴隨揮發(fā)性脂肪酸（VFA）增加、產(chǎn)甲烷量降低、污泥解體洗出等現(xiàn)象，DGGE圖譜顯示13 d后反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)開始穩(wěn)定，最終兩反

14、應(yīng)器內(nèi)群落組成存在著差異，在高溫（55 ）條件下細(xì)菌種群變化速率更快，厭氧消化反應(yīng)器在高溫條件更易建立。刑德峰等20應(yīng)用雙梯度變性梯度凝膠電泳（DGDGGE）監(jiān)測生物產(chǎn)氫反應(yīng)器微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和多樣性，反應(yīng)器啟動(dòng)初期微生物種群演替迅速，15 d達(dá)到頂峰后逐漸減少趨于零，群落結(jié)構(gòu)的多樣性下降，相似性隨著演替時(shí)間增加而升高，最后趨于穩(wěn)定。傅以鋼等21研究發(fā)現(xiàn)，城市污水處理系統(tǒng)在受到高濃度硝酸根離子沖擊后微生物生態(tài)系統(tǒng)通過種群間協(xié)同作用恢復(fù)到原有的多樣性，認(rèn)為Bacillales和-proteobacteria等優(yōu)勢菌群在處理過程中起著主要作用。STAMPER等22對(duì)可再生廢水處理系統(tǒng)的種群結(jié)構(gòu)

15、動(dòng)態(tài)演替研究發(fā)現(xiàn)，微生物種群的多樣性隨著BOD濃度的不同而變化。LAPARA等23探討不同溫度和操作條件對(duì)好氧生物廢水處理過程中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性的影響，DGGE圖譜揭示不同溫度條件下均獲得了獨(dú)特的微生物菌群結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為HRT同樣是污泥菌群結(jié)構(gòu)變化的調(diào)控因子之一。此外，TARTAKOVSKY等24采用HPLC化學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)UASB對(duì)五氯酚降解菌的快速篩選過程相繼將目標(biāo)污染物轉(zhuǎn)化為3,4,5-三氯酚、3,5-二氯酚、3-氯酚、苯酚，結(jié)合DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)反應(yīng)器啟動(dòng)17 d后出現(xiàn)Clostridium acetobutylicum/C.beijerinckii.，TCP對(duì)位脫氯伴隨有

16、兩個(gè)條帶出現(xiàn)，屬于Clostridium和Syntrophomonas/Syntrophobacter，DCP的間位脫氯也伴隨有Syntrophomonas和Syntrophus的出現(xiàn)，但這類菌也存在于對(duì)照反應(yīng)器中，由此可推斷PCP及其中間產(chǎn)物的還原脫氯應(yīng)Clostridium作用所致。LI等25在好氧污泥顆?；^程微生物動(dòng)態(tài)分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，污泥顆?；^程微生物種群結(jié)構(gòu)演替顯著，隨著污泥顆?；霈F(xiàn)特異性條帶。污泥顆?；^程微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)演替顯著，優(yōu)勢菌群分屬-, -Proteobacteria、Flavobacterium等類群。2.3 污泥微生物群落結(jié)構(gòu)研究雖然DGGE技術(shù)只能對(duì)微生物

17、群落多樣性、菌群種類進(jìn)行分析鑒定，無法獲得菌落形態(tài)、空間分布等信息，但結(jié)合熒光原位雜交（FISH）、點(diǎn)印跡雜交（Dot-blot hybridization ）等分子生物學(xué)技術(shù)，能夠克服DGGE技術(shù)的局限性，進(jìn)一步了解顆粒污泥、生物膜等特殊微生物系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)與功能。AHN等26研究了3組不同電子受體的SBR反應(yīng)器（RAA反應(yīng)器：O2，RAN反應(yīng)器：O2 、NO3，RNN反應(yīng)器：NO3）接種聚磷菌（PAOs）后的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，RNN內(nèi)污泥種群結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，而RAA的微生物種類較RAN少，每組反應(yīng)器內(nèi)均存在Rhodocyclus sp.和 Dechlorimonas sp.兩類反硝

18、化聚磷菌（DNPAOs）。FISH結(jié)果表明，Rhodocyclus sp.在3個(gè)反應(yīng)器中均屬于優(yōu)勢菌群，且呈葡萄串菌落形態(tài)存在，而Dechlorimonas sp.數(shù)量較少。厭氧生物反應(yīng)器效率跟氨氮濃度密切相關(guān)，氨氮濃度的不斷提高使UASB反應(yīng)器的COD去除效率下降，DGGE和FISH研究結(jié)果表明，產(chǎn)甲烷細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯的變化，Methanosaeta及相關(guān)菌群的豐度和活性下降，而Methanosarcina、Methanobacterium及Methanospirillium等菌群在反應(yīng)器運(yùn)行過程中能夠保持一定的數(shù)量級(jí)，但Methanosarcina從單一細(xì)胞聚集成為細(xì)胞群，認(rèn)為

19、這種存在形態(tài)有利于其抵抗高濃度氨氮沖擊影響，可維持反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定性27。膜好氧生物反應(yīng)器（MABR）通過膜腔體供氧，實(shí)現(xiàn)向反應(yīng)器的無泡曝氣，能夠在單一生物膜上完成硝化反硝化反應(yīng)。有研究表明28，與活性污泥相比MABR具有獨(dú)特而復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)；對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)隔膜附近的主要菌群為-和-Proteobacteria，而遠(yuǎn)離隔膜厭氧區(qū)域內(nèi)主要包括Bacteriodetes及-、-、-和-Proteobacteria等；對(duì)氨氧化菌（AOB）和反硝化菌（nirS，nirK）的競爭性定量PCR結(jié)果表明，2、14 cm/s流速下生物膜內(nèi)AOB、nirS和nirK的分布情況不同，由此可推

20、斷出流速是影響生物膜內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)的重要因素。LANTHIER等29采用厭氧固定膜反應(yīng)器（FF）降解PCP，DGGE結(jié)果表明，反應(yīng)器啟動(dòng)56 d后微生物群落趨于穩(wěn)定，與接種污泥相比生物膜內(nèi)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，相似性低于0.3；古細(xì)菌種類比細(xì)菌少，群落組成變化不明顯，表明產(chǎn)甲烷菌在UASB和厭氧FF反應(yīng)器內(nèi)的種類基本相同；結(jié)合FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)，由球菌、球桿菌和桿菌組成的細(xì)菌群落約占總菌群的70%，而古細(xì)菌豐度只有10%左右，大部分為甲烷菌，此外發(fā)現(xiàn)PCP降解菌Desulfitobacterium. Hafniense占總菌群的19%左右，分散于整個(gè)生物膜內(nèi)，這種特性有利于保持微生物群

21、落的穩(wěn)定。3 展 望迄今為止，以基因組DNA或RNA為研究對(duì)象的DGGE技術(shù)克服了傳統(tǒng)微生物方法的各種弊端，可快速表征微生物遺傳特性，已成為廢水處理過程微生物群落結(jié)構(gòu)分析、動(dòng)態(tài)演替監(jiān)測方面強(qiáng)有力的常規(guī)分子生物學(xué)研究手段，但同時(shí)還存在只能分析500 bp以下的DNA片段30、只能檢測到樣品中占1 %以上的優(yōu)勢菌群等局限性，此外細(xì)胞裂解是否充分、DNA提取和純化時(shí)的偏差、電泳操作條件的改變等都將影響DGGE的分析結(jié)果。盡管DGGE技術(shù)存在以上局限性，但其與實(shí)時(shí)定量PCR（real time and quantitative PCR）、16S rRNA文庫構(gòu)建（16S rRNA gene libra

22、ries）、FISH等分子生物技術(shù)相耦合，有望進(jìn)一步揭示微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能，借助于功能基因標(biāo)記或者信使RNA（mRNA）的PCR擴(kuò)增可獲得微生物群落內(nèi)部特定的代謝信息，此外結(jié)合傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、化學(xué)分析等方法可進(jìn)一步了解微生物的功能及其生理生態(tài)特性，為建立數(shù)學(xué)模型、設(shè)計(jì)處理系統(tǒng)及優(yōu)化操作等提供理論依據(jù)。綜上，結(jié)合其他分子生物學(xué)手段、傳統(tǒng)微生物技術(shù)和化學(xué)分析方法，對(duì)于豐富和發(fā)展廢水生物處理的微生物學(xué)理論、加強(qiáng)工程技術(shù)的可控性具有重要的意義。參考文獻(xiàn)1 WILDERER P A，BUNGARTZ H J，LEMMER H，et al.Moden science methods and their

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