實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦組織Toll樣受體4的表達(dá)及意義

1、實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦組織Toll樣受體4的表達(dá)及意義 作者：李俐濤，張祥建，尹靜，楊燚 【摘要】 目的: 探討TLR4在腦出血大鼠血腫周圍腦組織中的表達(dá)變化及其作用. 方法： 采用自體尾動(dòng)脈血注入法制作腦出血大鼠模型，將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組，造模完畢后按不同時(shí)間點(diǎn)（術(shù)后6,24,48,72 h和7 d）隨機(jī)分為5個(gè)亞組，每組5只. 各組于不同時(shí)間點(diǎn)取材，采用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)方法檢測(cè)大鼠腦組織TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá). 結(jié)果： 各實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA均表達(dá)，假手術(shù)組TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異（P0.05）；模型組與假手術(shù)組相比

2、TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著升高(P0.05)，且在48 h達(dá)高峰,持續(xù)到72 h. 模型組相同時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)與假手術(shù)組比較均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01）. 結(jié)論： 腦出血大鼠模型TLR4表達(dá)增高，提示TLR4在腦出血炎癥損傷中可能具有一定作用. 【關(guān)鍵詞】 腦出血；大鼠；Toll樣受體【Abstract】 AIM： To explore the expression of Toll like receptor 4 (TLR4) in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats a

3、nd its role in brain inflammatory injury. METHODS: The cerebral hemorrhage models of rats were made by injecting autologous arterial blood collected from caudal artery. Fifty male SD rats were randomly divided into 2 groups: sham operation and model groups. The expression of TLR4 mRNA in the brain t

4、issue surrounding hematoma was determined simultaneously by RT PCR. RESULTS: The expression of TLR4 gene in model group was higher evidently than that in sham operation group（P0.05). CONCLUSION: The expression of TLR4 is increased in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats. It

5、is indicated that TLR4 is increased in brain tissue surrounding hematoma of cerebral hemorrhage rats, which indicates that TLR4 might be involved in inflammatory reactions of intracerebral hemorrhage.【Keywords】 intracerebral hemorrhage; rat; Toll like receptor0 引言 腦血管病是臨床常見(jiàn)病之一,尤其腦出血具有較高的發(fā)生率、致殘率、病死率，

6、其中一個(gè)很重要的原因是出血后水腫的形成和發(fā)展，現(xiàn)已證明腦出血后的炎癥反應(yīng)是腦水腫的直接原因1. Toll 樣受體4 (Toll like receptor 4, TLR4)在跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族 TLRs中占有重要的位置2, 可介導(dǎo)細(xì)菌內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng). 研究3-4發(fā)現(xiàn), TLR4 與心、肝、腦缺血性非生物性炎性損傷關(guān)系密切,但TLR4 是否也參與了腦出血非生物性炎性損傷尚不清楚,我們采用自體尾動(dòng)脈血注入法建立大鼠腦出血模型，初步探討TLR4在腦出血非生物炎性損傷中的作用.1 材料和方法1.1 材料 健康雄性SD大鼠 50只，體質(zhì)量300 3

7、50 g，由河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供許可證號(hào)DK0403007，清潔級(jí). NARISHIGE SR6N腦立體定向儀（日本）；電子天平(日本AND HR120,精確度為0.1 mg)； RTPCR相關(guān)試劑(美國(guó)Promeger公司)；所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Eppendorf公司，572H)；低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5417R），凝膠成像分析系統(tǒng)(德國(guó)Eppendorf公司，SYNGENE).1.2 方法1.2.1模型制作 參照本實(shí)驗(yàn)室的方法進(jìn)行5，即將動(dòng)物用水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射麻醉后，取尾動(dòng)脈不抗凝血50 L，應(yīng)

8、用腦立體定向技術(shù)注入大鼠腦內(nèi)右側(cè)尾殼核，術(shù)畢用醫(yī)用骨蠟封閉針孔. 假手術(shù)組只進(jìn)針不注血.1.2.2動(dòng)物分組 將大鼠隨機(jī)分為腦出血組（25只）、假手術(shù)組（25只）. 造模完畢后按不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為5個(gè)亞組，即術(shù)后6,24,48,72 h和7 d,每組5只.1.2.3 標(biāo)本采集 于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭處死動(dòng)物，取血腫周圍腦組織，稱取100 mg，置于冰浴中的勻漿器并迅速勻漿，用于抽提總RNA，剩余組織置于液氮中，-80保存.1.2.4 血腫周圍腦組織總 RNA抽提與純化 在冰浴勻漿器中加入1 mL Trizol及100 mg組織，迅速研磨，將勻漿液裝于 EP管中，加入200 L氯仿劇烈震搖30 s，間隔

9、放冰盒保溫，反復(fù)震蕩，4，12000 g，低溫離心20 min，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一EP管中，加等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20過(guò)夜，4，12000 g，低溫離心20 min，棄上清，加750 mL/L乙醇700 L輕輕混勻，4，12000 g，低溫離心10 min，輕輕吸出上清，室溫垂直放置 2030 min涼干，加入 DEPC水 20 L溶解，留取 1 L待測(cè) RNA濃度.1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄 (RT合成第 1條鏈 cDNA) 在 PCR管中建立如下反應(yīng)體系:依次加入如下試劑:5×RT buffer 5 L，10 mmol/L dNTP 2.5 L，RNasin 1 L，Prime

10、r 1 L， M MLV 1 L，RNA及DEPC 水總共14.5 L. 短暫離心振蕩混勻4低溫短暫離心；在 PCR儀中, 37反轉(zhuǎn)錄 50 min,95 5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴， -20保存.1.2.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) TLR4引物的設(shè)計(jì) 從GenBank 中查到TLR4序列號(hào)為（#AF057025），用Gene Toll軟件設(shè)計(jì) TLR4上游引物為5 GCC GGA AAG TTA TTG TGG TGG T 3（2442-2463），下游引物為5 ATG GGT TTT AGG CGC AGA GTT T 3，（2776-2795），PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性 95

11、2 min后，變性95 40 s，退火52 40 s，延伸72 1 min，35個(gè)循環(huán)后72延伸10 min，PCR產(chǎn)物為356 bp. 內(nèi)參照 actin引物序列為:上游 5 GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA 3；下游: 5 GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG 3, 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 為375 bp. PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性 95 2 min后，變性 95 30 s，退火 52 30 s，延伸 72 40 s; 35個(gè)循環(huán)后，最后延伸 72 5 min.1.2.7 PCR 產(chǎn)物的電泳鑒定 將各樣品PCR 產(chǎn)物5 L（ actin 5 L）加于20 g/L瓊

12、脂糖凝膠電泳槽齒孔中，取PCR標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳，作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照. 1×TBE 50 V恒壓電泳 4060 min,取膠置凝膠成像系統(tǒng)中，紫外光下拍照，結(jié)果掃入電腦備處理. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：電泳條帶密度值以（灰度 ×面積）/（參照物的灰度 ×面積）表示. 數(shù)據(jù)均以x±s表示，運(yùn)用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理. 所有數(shù)據(jù)用 SAS統(tǒng)計(jì)軟件處理. 2 結(jié)果 兩組各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA/ actin mRNA灰度比值表明：各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA均表達(dá)，假手術(shù)組TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著差異（P0.05，表1，圖1）；模型組與假手術(shù)組相比TLR4 m

13、RNA相對(duì)表達(dá)顯著升高，且在48 h達(dá)高峰,持續(xù)到72 h. 各時(shí)間點(diǎn)TLR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)與假手術(shù)組比較均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）. 表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織TLR4 mRNA水平的比較（略）1，7：假手術(shù)； 2，8：術(shù)后6 h； 3，9：術(shù)后24 h； 4，10：術(shù)后48 h；5，11：術(shù)后72 h； 6，12：術(shù)后7 d； M: marker.圖1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織TLR4 mRNA表達(dá)（略）3 討論 腦出血損傷見(jiàn)于許多臨床病理過(guò)程，影響這一過(guò)程的因素是多方面的. 一般認(rèn)為，腦出血損傷是典型的非感染性炎癥，氧自由基的產(chǎn)生及炎癥介質(zhì)的釋放是其重要機(jī)制. 近年認(rèn)為

14、TLR4在非感染性炎癥損傷中起重要作3-4. TLRs屬于I類跨膜受體,在TLRs家族中，TLR4的結(jié)構(gòu)及其參與促炎反應(yīng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞成熟分化及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等方面研究的較為清楚. 目前已證實(shí)人和鼠腦內(nèi)有眾多的TLR4表達(dá)6，TLR4廣泛分布腦室周圍血管叢，小膠質(zhì)細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，腦內(nèi)血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞也表達(dá)TLR4 mRNA. 內(nèi)、外源性激活均可激活 TLR4,激活的 TLR4 招募胞內(nèi)髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88, MyD88),將信號(hào)傳至NFB, 最終導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫哦a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng). TLRs家族不僅識(shí)別外源性

15、微生物，而且識(shí)別內(nèi)源性有害物質(zhì)7，如參與調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)壞死細(xì)胞、熱休克蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物等的應(yīng)答. 最近研究證實(shí)8-9TLR4在誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，小膠質(zhì)細(xì)胞是損傷介質(zhì)的主要來(lái)源. TLR4作為炎性跨膜受體在感染性疾病研究領(lǐng)域中已是熱點(diǎn). 近年來(lái)，TLR4在非生物性炎癥損傷中的作用引起了人們的關(guān)注. 腦出血后血腫周圍的炎癥損傷成為造成腦水腫的直接原因1，此點(diǎn)已被證實(shí)，腦出血后的炎癥損傷是否與TLR4有關(guān)呢？ 我們的實(shí)驗(yàn)中假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)變化無(wú)差異，腦出血組6 h表達(dá)類似假手術(shù)組，但24,48,72 h和7 d TLR4 mRNA則相對(duì)表達(dá)明顯增多，于出血后48 h達(dá)高峰，并持

16、續(xù)到72 h，由此可以推斷，出血后損傷組織釋放的內(nèi)源性激活物被TLR4識(shí)別后，啟動(dòng)了TLR4的信號(hào)傳導(dǎo)通路，并進(jìn)一步激活NFB而釋放致炎細(xì)胞因子，造成組織損傷. TLRs強(qiáng)烈激活會(huì)導(dǎo)致高水平炎性細(xì)胞因子的分泌，從而加重細(xì)胞的損傷10. 這說(shuō)明TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑在腦組織損傷所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中具有重要的作用. 總之,對(duì) TLR4在腦出血炎癥損傷中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有助于闡明固有免疫的啟動(dòng)與機(jī)體基本應(yīng)激反應(yīng)性損傷之間的聯(lián)系, 并可能從炎癥反應(yīng)起點(diǎn)控制的角度揭開(kāi)炎癥因子參與腦出血損傷發(fā)生發(fā)展的機(jī)制.【參考文獻(xiàn)】 1 Zhang X, Li H, Hu S, et al. Brain edema

17、 after intracerebral hemorrhage in rats:The role of inflammationJ. Neurol India, 2006, 54(4): 402-407.2 Medzhitov R, Preston Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunityJ. Nature, 1997, 388(6640): 394-397.3 Li C, Ha T, Kelley J,

18、et al. Modulating Toll like receptor mediated signaling by (1>3) betaDglucan rapidly induces cardiop rotectionJ. Cardiovasc Res, 2004, 61(3): 538-547.4 Cao CX， Yang QW, LV FL, et al. Reduced cerebral ischemia reperfusion injury in Toll like receptor 4 deficient miceJ. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 353 (2): 509-514.5 張祥建，劉春燕，祝春華，等. 大鼠自體動(dòng)脈血腦出血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕.腦與神經(jīng)疾病雜志，2003，11(6): 341.6 Tammy K. TollLike Receptors in Central Nervous System Glial Inflammation and HomeostasisJ. J Neurosci Res, 2006, 83(5): 711-730.7 BEG