基質(zhì)固相分散

1、美國(guó)路易斯安那州立大學(xué)Steven A. Barker教授，自1989年首次提出了基質(zhì)固相分散（matrix solid phase dispersion，MSPD）11的樣品前處理技術(shù)，作為一種專利工藝，最初是用于從動(dòng)物組織中分離有機(jī)磷酸酯類、苯并咪唑驅(qū)蟲藥和-內(nèi)酰胺抗生素類藥物，文章表明了MSPD萃取次數(shù)少、消耗更少量的溶劑、可同時(shí)執(zhí)行提取和凈化過(guò)程，同時(shí)Barker教授也對(duì)MSPD給予了理論解釋。Barker在2000年、2007年陸續(xù)發(fā)表了相關(guān)研究的綜述文章1214，總結(jié)和評(píng)論了該前處理手段在食品分析領(lǐng)域每隔十年的發(fā)展和進(jìn)步。MSPD作為簡(jiǎn)單的樣品提取技術(shù)，越來(lái)越多地被用來(lái)從固體、半固

2、體、高粘性的環(huán)境、生物基質(zhì)中提取有機(jī)污染物或藥物，也逐漸成為了天然產(chǎn)物的提取手段。MSPD方法采用親脂性固相填料C18，與固體、半固體、高粘性液體一起研磨，得到半干燥的顆粒混合物，易于作為填料裝柱，裝入萃取柱或注射器針筒里，然后可以用極性、非極性的多種有機(jī)溶劑充當(dāng)洗脫劑，將各種待測(cè)藥物、污染物等從生物基質(zhì)中分離出來(lái)。C18聚合物通過(guò)破壞和分散細(xì)胞膜磷脂、組織液成分、細(xì)胞內(nèi)成分、膽固醇等，充當(dāng)分散劑的作用。其工作原理為：樣品組織與固體材料研磨的過(guò)程中，有機(jī)相與硅膠固相萃取材料表面相互鍵合，利用剪切力作用將組織分散，樣品組分溶解和分散在固體支持物表面，這大大增加了萃取樣品的表面積，樣品會(huì)按照各自的

3、極性分布在有機(jī)相物質(zhì)表面。近年來(lái)，發(fā)展了一些可替代性的分散劑材料，如酸性SiO2、石英砂、丙烯酸類聚合物、硅藻土和Al2O3，這些材料的運(yùn)用可以增強(qiáng)MSPD的選擇性。然而，基質(zhì)固相分散技術(shù)常用的分散劑缺乏選擇性。利用MSPD對(duì)樣品進(jìn)行前處理，需要根據(jù)樣品的性質(zhì)和待分析的物質(zhì)，對(duì)分散劑、洗脫劑進(jìn)行優(yōu)化，必要時(shí)還需要對(duì)洗脫液進(jìn)行進(jìn)一步的處理和純化。洗脫劑的選擇，主要取決于基質(zhì)的性質(zhì)和待測(cè)物分子的極性。為了提高基質(zhì)固相分散技術(shù)的選擇性，樣品經(jīng)分散劑處理后，凈化過(guò)程也逐漸顯得尤為重要。圖2.1基質(zhì)固相分散過(guò)程15 (I) 將樣品與分散劑混合研磨; (II) 將均化后的混合物粉末轉(zhuǎn)移到注射器針筒中，壓實(shí)

4、; (III) 使用真空泵控制流速，用溶劑/混合溶劑來(lái)洗脫目標(biāo)化合物2.2實(shí)驗(yàn)部分2.2.1 試劑與材料磺胺類藥物，包括磺胺噻唑（Sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺甲基異惡唑（Sulfamethoxazole）及磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine）購(gòu)于北京百靈威科技有限公司（北京，中國(guó)），四種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)如圖2.2所示。準(zhǔn)確稱取適量的磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜級(jí)乙腈配制成濃度為500 g mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 冰箱中待用，使用時(shí)以乙腈逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。實(shí)驗(yàn)中所用的色譜純的乙腈、甲醇購(gòu)于F

5、isher 公司（美國(guó)）；分析純的甲醇、丙酮及乙酸乙酯購(gòu)于北京化工廠（中國(guó)），實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q 水處理系統(tǒng)（美國(guó)）制得的二次蒸餾水。3種不同類型分散劑，包括硅膠（100目）、硅藻土（400目）及中性氧化鋁（200目）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。使用之前，將分散劑置于650 條件下灼燒4 h，之后烘干2 h，置于干燥的密封容器中保存。本實(shí)驗(yàn)選取的牛肉樣品均購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?，通過(guò)絞肉機(jī)將其絞至肉泥狀，置于-20 冰箱中保存待用。2.2.2儀器與設(shè)備超快速液相色譜儀（LC-20ADXR，日本島津公司），紫外檢測(cè)器（SPD-20A），色譜柱（Sulfa C18，150 mm×4.6

6、mm，3 mm，日本島津公司）。基質(zhì)固相分散裝置由10 mL 玻璃材質(zhì)注射器自制而成。2.2.3 樣品制備準(zhǔn)確稱取0.20 g牛肉樣品于瑪瑙研缽中，加入一系列適當(dāng)濃度的工作溶液，研磨20 min直至混勻，于暗處干燥12 h待用。2.2.4 樣品處理準(zhǔn)確稱取0.2 g牛肉樣品于研缽中，加入一定質(zhì)量的分散劑，研磨15 min直到均勻。取一只10 mL注射器，在其底部放入一層脫脂棉，加入0.5 g分散劑作為凈化層，然后將混合物轉(zhuǎn)移至注射器內(nèi)，另取一層脫脂棉置于混合物上方，使用注射器活塞將基質(zhì)固相小柱壓實(shí)。取適量的洗脫液重力洗脫待測(cè)目標(biāo)物。收集洗脫液于試管中，用氮?dú)獯蹈?，使用乙腈定容?00 

7、1;L，過(guò)0.22 µm濾膜，所得溶液為分析溶液，供液相色譜分析。2.2.5 超快速液相色譜條件流動(dòng)相A為水，B為乙腈。流動(dòng)相為A ：B = 70 ：30（V / V)，流速為0.4 mL min-1，柱溫箱溫度為40 ，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，進(jìn)樣體積為5 L。2.3 結(jié)果與討論2.3.1 條件優(yōu)化為了得到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)影響基質(zhì)固相分散提取的條件均進(jìn)行了優(yōu)化，包括分散劑的種類、洗脫劑種類、洗脫劑用量、樣品與分散劑質(zhì)量比。在條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，加標(biāo)樣品的濃度為1250 ng g-1，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。2.3.2 分散劑的種類通過(guò)MSPD提取牛肉樣品中的4種磺胺類藥物殘留，為了獲得較

8、高的提取效果，本實(shí)驗(yàn)分別考察了硅膠、硅藻土及中性氧化鋁作分散劑時(shí)的提取和凈化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.3所示，當(dāng)硅膠和中性氧化鋁作為分散劑使用時(shí)，對(duì)樣品的分散效果不理想，4種磺胺類化合物回收率較低；當(dāng)選用硅藻土作為分散劑時(shí)，對(duì)目標(biāo)物的提取能力最強(qiáng)，回收率高于其它兩種分散劑。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇硅藻土作為MSPD的分散劑。圖2.3分散劑對(duì)磺胺類化合物回收率的影響牛肉樣品：0.2 g。洗脫劑：乙腈。洗脫劑體積：6 mL。樣品與分散劑質(zhì)量比為1:42.3.3 洗脫劑的種類為了獲得較高的提取效果，本實(shí)驗(yàn)分別選取了不同極性的洗脫溶劑，包括乙腈、甲醇、丙酮及乙酸乙酯，考察不同的溶劑對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果

9、如圖2.4所示，結(jié)果表明，丙酮對(duì)于磺胺噻唑具有較好的提取效果，而對(duì)磺胺甲基嘧啶、磺胺甲基異惡唑及磺胺間二甲氧嘧啶的洗脫能力很弱，提取效果不佳；選取乙腈和乙酸乙酯作為洗脫劑時(shí)，四種磺胺類藥物的回收率有所提高；而選取甲醇作為洗脫劑時(shí)，回收率明顯提高。由于甲醇對(duì)磺胺類藥物較強(qiáng)的洗脫能力，因此選擇甲醇作為MSPD的洗脫劑。圖2.4洗脫劑對(duì)磺胺類化合物回收率的影響牛肉樣品：0.2 g。分散劑：硅藻土。洗脫劑體積：6 mL。樣品與分散劑質(zhì)量比為1:42.3.4 洗脫劑的體積由于洗脫劑體積對(duì)目標(biāo)化合物的提取效果具有一定影響，因此洗脫劑體積在本實(shí)驗(yàn)中被考察。本實(shí)驗(yàn)中甲醇作為洗脫劑，選取體積為4，6，8，10

10、mL的甲醇用于洗脫。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.5所示，當(dāng)洗脫劑體積從4 mL 增加到6 mL時(shí), 磺胺類化合物的回收率隨洗脫劑體積的增加而增大；當(dāng)洗脫劑體積由6 mL增加到 10 mL時(shí)，四種化合物的回收率稍有降低。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇6 mL的甲醇作為洗脫劑。圖2.5洗脫劑體積對(duì)磺胺類化合物回收率的影響牛肉樣品：0.2 g。分散劑：硅藻土。洗脫劑：甲醇。樣品與分散劑質(zhì)量比為1:42.3.5 樣品與分散劑質(zhì)量比本實(shí)驗(yàn)中，分別選取0.4，0.6，0.8 和 1.0 g 硅藻土作為分散劑，使樣品與分散劑質(zhì)量比分別為12，13，14和15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.6所示，當(dāng)硅藻土質(zhì)量由0.4 g 增加到0.8 g，隨著硅

11、藻土質(zhì)量的增加，四種磺胺類化合物回收率顯著提高；由0.8 g 增加到1.0 g時(shí)，回收率出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，這是由于分散劑質(zhì)量越大，對(duì)目標(biāo)化合物的吸附作用也隨之增強(qiáng)，導(dǎo)致洗脫不完全。因此，14為樣品與分散劑的最佳質(zhì)量比。圖2.6樣品與分散劑的質(zhì)量比對(duì)磺胺化合物回收率的影響牛肉樣品：0.2 g。分散劑：硅藻土。洗脫劑：甲醇。洗脫劑體積：6 mL2.3.6 工作曲線、線性范圍、檢出限和定量限在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)一系列不同加標(biāo)濃度（25 2500 ng g-1）的牛肉樣品，根據(jù)得到的4種磺胺類化合物的色譜峰面積A與樣品中磺胺類藥物的濃度c進(jìn)行線性回歸，創(chuàng)建工作曲線。線性方程，相關(guān)系數(shù)，檢出限（LOD，

12、S/N=3）及定量限（LOQ，S/N=10）列于表2.1中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 種磺胺類化合物在25 2500 ng g-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.9995 0.9998；檢出限在4. 39 7. 82 ng g-1之間，定量限處于14.62 26.08 ng g-1之間。表2.1 4種磺胺類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限AnalyteLinear range(ng/g)Calibration equationsCorrelation coefficient (r)LOD (ng/g)LOQ (ng/g)Sulfathiazole252500y = 22.67x +119

13、43.00.99957.8226.08Sulfamerazine252500y = 25.11x + 1324.700.99984.3914.62Sulfamethoxazole252500y =24.76x + 3292.750.99965.4218.07Sulfadimethoxine252500y =28.90x + 3143.450.99955.7219.072.3.7 精密度為了考察方法的精密度，對(duì)牛肉樣品進(jìn)行不同加標(biāo)水平的分析。日內(nèi)精密度為在同一天內(nèi)平行測(cè)定五次樣品，而日間精密度為連續(xù)五天，每天分析一次樣品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2.2所示，4種磺胺類化合物的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.

14、9% 12.4% 和2.1% 12.7%。表2.2 4種磺胺類化合物回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）AnalyteConcentration (ng/g)Intra-dayInter-dayRecovery (%)RSD (%)Recovery (%)RSD(%)7590.724.286.005.3Sulfathiazole20099.851.998.282.150099.745.197.945.675111.865.3109.307.9Sulfamerazine200113.136.2106.475.850092.485.393.396.07595.5912.495.6412.7Sulfame

15、thoxazole20074.314.372.556.350092.202.687.936.87580.689.179.287.7Sulfadimethoxine20071.736.273.629.6500103.437.9105.078.42.3.8 樣品分析為考察方法的適用性，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)市場(chǎng)上購(gòu)買的3份牛肉樣品，4 種磺胺類藥物均未檢測(cè)出殘留?？瞻讟悠泛图訕?biāo)樣品的液相色譜圖如圖2.7所示，由圖可知空白樣品中無(wú)磺胺類化合物檢出，并且在目標(biāo)化合物的保留時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯的干擾峰。為考察方法的穩(wěn)定性，選取牛肉樣品 1，對(duì)樣品1進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2.2所示，四種磺胺類化合

16、物在不同的加標(biāo)水平下的回收率為71.73 % 113.13 %，回收率良好，該方法適合牛肉樣品中磺胺類化合物的測(cè)定。圖 2.7牛肉空白樣品（A）及加標(biāo)樣品（B）的色譜圖加標(biāo)濃度為250 ng g-1，1-磺胺噻唑，2-磺胺甲基嘧啶，3-磺胺甲基異惡唑，4-磺胺間二甲氧嘧啶2.4小結(jié)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基質(zhì)固相分散方法，建立了牛肉中4種磺胺類化合物殘留的測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)考察了分散劑的種類、洗脫劑種類、洗脫劑用量、樣品與分散劑質(zhì)量比等影響基質(zhì)固相分散提取的條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用硅藻土作為分散劑，6 mL甲醇用于洗脫目標(biāo)化合物，1:4為樣品與分散劑的最佳比例。本方法具有實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、樣品處理時(shí)間短、提取效率高

17、、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)調(diào)整相應(yīng)的MSPD條件，該方法有希望應(yīng)用到血液、肝臟等其它動(dòng)物樣品中磺胺類化合物的測(cè)定。2.5參考文獻(xiàn)1 Kaihara A,Yoshii K, Tsumura Y,Ishimitsu S, TonogaiY.Multi-residue Analysis of 18 Pesticides in Fresh Fruits,Vegetables and Rice by Supercritical Fluid Extraction and Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass SpectrometryJ.J. H

18、ealth Science,2002,48(2):173-1782 Aguilera A, Rodr´guez M, Brotons M, Boulaid M, Valverde A. Evaluation of supercritical fluid extraction/aminopropyl solid-phase "in-line" cleanup for analysis of pesticide residues in riceJ.J.Agric. Food Chem.,53(24):9374-93823 Valverde A, Aguilera A,

19、 Rodriguez M, Brotons M.Evaluation of a multiresidue method for pesticides in cereals using supercritical fluid extraction and gas chromatographic detection.J. Environ.Sci. Health, Part B,2009,44(3):204-2134 康永鋒，鄒世文，段吳平，李艷，孫濤. 超聲波-微波輔助提取-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)羊肉組織中 4 種非甾體抗炎藥物殘留J. 色譜, 2010, 28(11): 1056-10605 B

20、errada H, Borrull F, Font G, Marce R M. Determination of macrolide antibiotics in meat and fish using pressurized liquid extraction and liquid chromatography-mass spectrometryJ. J. Chromatogr. A, 2008, 1208(1-2): 83896 Lambropoulou DA, Albanis TA.Methods of sample preparation for determination of pe

21、sticide residues in food matrices by chromatography-mass spectrometry-based techniques: a reviewJ.Anal. Bioanal. Chem.,2007,389(6):1663-16837 Mol HGJ, Rooseboom A, Dam R, Roding M, Arondeus K, Sunarto S. Modification and re-validation of the ethyl acetate-based multi-residue method for pesticides in

22、 produceJ. Anal. Bioanal. Chem. 2007,389(6):1715-17548 Wei F, Feng Y Q. Methods of sample preparation for determination of veterinary residues in food matrices by porous monolith microextraction-based techniquesJ. Analytical Methods, 2011, 3(6): 124612569 謝維平，歐陽(yáng)燕玲，黃盈煜，陳春祝.凝膠滲透色譜凈化-高效液相色譜法測(cè)定魚肉中的 5 種激

23、素類藥物殘留J. 色譜, 2010, 28(4): 388-39210 黃運(yùn)紅，許楊，杜碧柏，何慶華，曹郁生.分子印跡柱-高效液相色譜法測(cè)定豬肉中磺胺嘧啶J.分析化學(xué), 2012, 40(7): 1011-101811 Baker S A,Long A R, Short C R. Isolation of drug residues from tissues by solid phase dispersionJ. Journal of Chromatography A, 1989, 475(2): 35336112 Baker S A. Matrix solid-phase dispersio

24、nJ. Journal of Chromatography A, 2000, 885(12): 11512713 Baker S A. Applications of matrix solid-phase dispersion in food analysisJ. Journal of Chromatography A, 2000, 880(12): 636814 Baker S A. Matrix solid phase dispersion (MSPD)J. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 2007, 70(2): 15116

25、215 Capriotti A L, Cavaliere C, Giansanti P, Riccardo Gubbiotti, Roberto Samperi, Aldo Laganà. Recent developments in matrix solid-phase dispersion extractionJ. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(16): 2521253216 蔣原，沈崇鈺，姚義剛，丁濤，賈濤，趙厚民，徐錦忠. 動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物增效劑殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定J.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28（7）：83483717 Maudens KE, Zhang GF, Lambert WE.Quantitative analysis of twelve sulfonamides in honey after acidic hydrolysis by high-performance liquid chromatography with post-column derivatization and fluorescence detectionJ.J. Chromatogr. A., 2004, 1047(1):85-9218 So Young