REACH法規(guī) 第五卷譯稿-23VIP

1、C.15 魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗1 方法這個短期的毒性實(shí)驗是重復(fù) OECD TG 212（1998）上的。1 引言這個魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗是一個將生命從受精卵到幼苗期這段時間暴露在危險中的短期實(shí)驗。在胚胎期和幼苗期沒有飼料提供，而實(shí)驗將這樣終止，但是幼苗仍將從卵囊中繼續(xù)培養(yǎng)。本實(shí)驗打算劃定在測定的特殊時期和種類中足以致死的和非致死的化學(xué)物質(zhì)。這個實(shí)驗將提供許多有用的信息包括：a、是一座架在致死和非致死間的橋梁；b、可以作為一個對不完全初期生物時期或慢性毒物的審查性實(shí)驗；c、對在某處耕作技術(shù)還未充分發(fā)展到可以包括內(nèi)部生長到內(nèi)部飼養(yǎng)改變時期的物種做測定?？赡苷J(rèn)為只有混合魚生命

2、循環(huán)中所有周期的實(shí)驗才可能對慢性毒物對魚的影響作出一個準(zhǔn)確的評估，而且那些在生命各時期方面減少的暴光度可能會減少敏感度而因此低估了慢性毒物。為此預(yù)計胚胎期和幼苗期實(shí)驗特別是在一些高親脂性化合物及有特殊毒性效果的化學(xué)物質(zhì)方面不如全程生命實(shí)驗敏感。盡管如此，可能在2個實(shí)驗中有一些不特殊的有麻醉效果的物質(zhì)在敏感性上有更微小的差異（1）。在發(fā)表這個實(shí)驗之前，這種胚胎-幼苗期實(shí)驗的經(jīng)驗多以一種叫Danio rerio的淡水魚（硬骨魚，鯉科，普通名稱斑馬魚）。更多關(guān)于這個系列的實(shí)驗演示的詳細(xì)指導(dǎo)在附件1中給出。這個并未避開使用其他可用的經(jīng)驗（表格1）。1 定義最低觀測影響濃度（LOEC）：是一種被觀測物質(zhì)

3、在對比于對照實(shí)驗有明顯影響（當(dāng)p<0.05）的情況下在測定的最低濃度。無觀測影響濃度（NOEC）：是實(shí)驗濃度中低于LOEC的濃度。 實(shí)驗原理胚胎和幼苗期的魚被暴露在一系列不同濃度的溶有實(shí)驗物質(zhì)的水中。在草案中，可能要在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗和流動法實(shí)驗中做出一個選擇。而這個選擇取決于實(shí)驗物質(zhì)的性質(zhì)。這個實(shí)驗始于將受精卵放入實(shí)驗擴(kuò)展槽中而終于在任一實(shí)驗擴(kuò)展槽中的卵黃被幼蟲全部同化之前或饑餓死亡率超出對照之前。將致死和非致死影響與對照實(shí)驗對比、評估，并測出LOEC和NOEC。相互地，也可以用回歸分析來估計濃度而導(dǎo)致的百分比影響（即：LC/Ecx，這里x定義為影響百分比）。 實(shí)驗物質(zhì)信息一個精確的毒性實(shí)驗

4、結(jié)果能更好的顯示出一系列對實(shí)驗的選擇，是可利用的。這個實(shí)驗結(jié)果可以用在選擇早期生命實(shí)驗中可處理的實(shí)驗濃度范圍。還要知道實(shí)驗物質(zhì)在水中的溶解性（包括在實(shí)驗用水中的溶解性）和實(shí)驗物質(zhì)的飽和蒸汽壓。在一個已知的、精確實(shí)驗結(jié)果報告并且限量探測的實(shí)驗方案中一個可靠的物質(zhì)定量分析方法是有效的。結(jié)構(gòu)公式，物質(zhì)的純度，在水中和光照下的穩(wěn)定性，Pka，Pow以及預(yù)備生物降解的結(jié)果都是有用的信息。 實(shí)驗的有效性對一個有效的實(shí)驗，應(yīng)當(dāng)遵循以下幾點(diǎn)：所有對照實(shí)驗中相關(guān)的繼續(xù)存活的受精卵及相關(guān)在僅溶的容器中的量不少于附件、中所定義的限制；在整個實(shí)驗中溶解的氧氣濃度必須在空氣飽合含量的60%100%之間；在實(shí)驗擴(kuò)展槽或整

5、個實(shí)驗中任何連續(xù)幾天時間水溫變化不超過±，并且在一系列實(shí)驗中指定的溫度范圍內(nèi)（附件2、3）。1.實(shí)驗方法描述實(shí)驗擴(kuò)展槽可以使用任何玻璃或其他任何化學(xué)惰性容器。容器的尺寸應(yīng)大至足夠允許滿足投放比率（見章節(jié)）。要求實(shí)驗擴(kuò)展槽在實(shí)驗地區(qū)的某一隨機(jī)位置。當(dāng)存在實(shí)驗室系統(tǒng)誤差時，一個對每個分步驟處理方式的分步驟預(yù)想對完全隨機(jī)方案是有好處的，并能夠進(jìn)行適當(dāng)控制。分步驟，如使用，要注意隨后的數(shù)據(jù)處理，而實(shí)驗擴(kuò)展槽要小心防備以外打擾。 魚品種的選擇可接受的魚的品種在表格1A中已給出。這里不能避免使用其他種類（例如：在表格1B中所列出的），但實(shí)驗步驟上可能不得不提供更好的實(shí)驗條件來適應(yīng)實(shí)

6、驗步驟。在這種條件下實(shí)驗結(jié)果報告出了選擇的基本原則和實(shí)驗方法。養(yǎng)殖魚種類的選擇關(guān)于養(yǎng)殖魚種類的細(xì)節(jié)可在OECD TG 210和參考文獻(xiàn)（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中找到。 胚胎和幼苗的處理在主容器中，胚胎和幼苗是暴露在外的，在小點(diǎn)的容器中在側(cè)面和底部安裝網(wǎng)使得容器里允許實(shí)驗的水流動。那些計劃好的懸浮在臂狀物上的小容器使得容器上下?lián)u動會產(chǎn)生不狂暴的水流流過小容器，但總能保持有機(jī)體浸沒在水中。在使用一個虹吸系統(tǒng)。鮭魚的受精卵被放在有足夠幼魚孵化后離開的孔的網(wǎng)或架子上。巴斯德移液管的用處是適當(dāng)?shù)貙⑴咛ズ陀酌缫频桨敕€(wěn)態(tài)實(shí)驗中并每日都重復(fù)（見章節(jié)1.6.6）。在大容器中放有卵的格子或網(wǎng)是卵的容

7、器。這些限制可以在幼苗孵化后移除，但要保留一些以阻止魚逃跑。如果有需要遷移幼苗，它們就不能暴露在空氣中且網(wǎng)不應(yīng)用來將魚從卵容器中放出來（對于一些易碎種類如鯉魚，這個警告不必要）。對于這個遷移而安排的時間隨種類而改變而且遷移并不一定是必要的。對半穩(wěn)態(tài)技術(shù)，如必要也可使用燒杯或淺底容器，并在其底部上方裝一個紗網(wǎng)且比燒杯底略微提高一點(diǎn)。如果這組容器足夠滿足裝樣要求，那遷移胚胎和幼苗是沒必要的。 水類似列在附件4的符合可接受的稀釋物的化學(xué)性質(zhì)的任何水和那些在附件2、3中描述的可以且可能好的展示實(shí)驗效果的水都是合適的實(shí)驗用水。在整個實(shí)驗過程中水的性質(zhì)要不變。而pH則只能在單位內(nèi)波動。為保證稀釋水不會不正

8、當(dāng)?shù)赜绊憣?shí)驗實(shí)驗結(jié)果（例如與實(shí)驗物質(zhì)生成配位化合物），或反之影響繁殖用的卵的演示。在不同區(qū)間取樣進(jìn)行分析。重金屬（如Cu、Pb、Zn、Hg、Cl、Ni）、主要的陰離子、陽離子（如Ca2+、Mg2+、K+、Cl-、SO42-）、農(nóng)藥（如全部含磷、含氯的有機(jī)物）、全部含碳有機(jī)物和懸浮的土壤的含量都要準(zhǔn)備好。例如每3個月測定一次以保證稀釋水的性質(zhì)是不變的。如能證明水質(zhì)至少一年保持不變，測定可以不必太頻繁，周期可長一些（如每6個月一次）。 實(shí)驗溶液選擇濃度的實(shí)驗方法是由繁殖溶液的稀釋來決定的。單純地通過機(jī)械方式（如攪拌機(jī)和超聲波）簡單的混合或搖動實(shí)驗物質(zhì)可以更好地為繁殖溶液做準(zhǔn)備。飽和柱（溶解柱）可用

9、來完成一個濃縮的繁殖溶液。盡可能地避免使用溶劑或分散劑（溶解藥劑）。盡管如此，在一些情況下也可用該類物質(zhì)制備適合繁殖的合適濃度的儲備液，的例如丙酮、乙醇、甲醇、DMF、和三甘醇二甲醚都是較好的溶劑。而cremophor RH40、Tween 80、0.01%甲基纖維素和HCO40是較好的分散劑。當(dāng)使用易為生物分解的藥劑（如丙酮）和那些在流通實(shí)驗中因易揮發(fā)而導(dǎo)致細(xì)菌組合出問題的藥劑時要特別注意。當(dāng)使用一種溶解劑的時候，它絕對不能對魚的生存構(gòu)成威脅或產(chǎn)生在早期生命時期可觀測到的不利影響。盡管如此，在使用類似材料時盡可能避免產(chǎn)生任何影響。對半穩(wěn)態(tài)技術(shù)，要進(jìn)行2個不同的重復(fù)步驟(i)要么為新的實(shí)驗準(zhǔn)備

10、干凈的容器并在不接觸空氣條件下將生存的卵和幼苗從原來的舊溶劑中遷移到新容器；(ii)要么將有機(jī)體保持在容器中同時換一定比例（不少于3/4）的實(shí)驗用水。更新的頻率取決于實(shí)驗物質(zhì)的穩(wěn)定性但每天換水是必要的。如果通過初步穩(wěn)定性實(shí)驗發(fā)現(xiàn)實(shí)驗物質(zhì)濃度再更新期間不能穩(wěn)定（即：超出標(biāo)準(zhǔn)濃度80%120%的范圍或低于80%），則考慮使用流通法進(jìn)行實(shí)驗。無論如何，在水更新操作要小心，以免壓迫幼苗。對流通性實(shí)驗，需要一個能持續(xù)分配、稀釋繁殖溶液的系統(tǒng)（如測量泵，比例稀釋器，飽和系統(tǒng)）來制備一系列濃度的展開槽。繁殖溶液和稀釋水的流速要在每日不同時間段控測并且在全部實(shí)驗中變化不超過10%。一個合適的流速要求在24小時

11、中流過至少5個實(shí)驗展開槽（2）。17 測定步驟魚在胚胎期和幼苗期的短期毒性實(shí)驗演示中的有效信息在文獻(xiàn)中可查得。一些例子可在文獻(xiàn)（7）、（8）、（9）中查得。 暴露條件 持續(xù)時間這個實(shí)驗最好在卵受精后30分鐘內(nèi)開始。在胚盤分裂初期或胚囊初期前后將胚胎浸入實(shí)驗溶液。對于大量獲得的卵不可能在受精后立刻開始實(shí)驗。推遲實(shí)驗會嚴(yán)重影響實(shí)驗的敏感度。這個實(shí)驗應(yīng)在受精后8小時開始。在暴露期幼苗禁止喂食。實(shí)驗終止于任一幼蟲將卵黃完全吸收光為止或餓死率超出對照之前。持續(xù)的時間長短取決于使用的材料種類。在附件2、3中給出了可接受的持續(xù)時間。裝樣在實(shí)驗開始前受精卵的數(shù)量應(yīng)當(dāng)足以達(dá)到統(tǒng)計要求。它們應(yīng)隨機(jī)分

12、布在整個系統(tǒng)中。并且30個受精卵，平均分配到至少3個同樣的實(shí)驗擴(kuò)展槽中，應(yīng)當(dāng)使用在每一濃度而裝樣比率（每份實(shí)驗溶液的生物量）應(yīng)當(dāng)足夠低到可以溶解的氧氣濃度在通風(fēng)環(huán)境下至少保持占60%ASV（美國標(biāo)準(zhǔn)）。對流通法來說，裝樣比率不超過24小時0.5g/L，而且要求無論何時對溶液說不超過5g/L。光照和溫度光照時間和實(shí)驗水溫要適合所實(shí)驗的種類（附件2、3），使用溫控儀的目的是，它可以在附加實(shí)驗容器上使用。1.7.2 實(shí)驗濃度一般地，要求5組實(shí)驗物質(zhì)濃度間隔恒定在不超過3.2。在選擇實(shí)驗濃度的范圍時，要考慮相關(guān)的LC50對光照時間的曲線。在一些條件下，少于5個濃度如一些限制實(shí)驗或一個更狹

13、小的濃度區(qū)間的用處是適當(dāng)?shù)?。如果少?個濃度，則要提供理由。物質(zhì)濃度要高于96小時 LC50或100mg/L，低于任何一個則無須測定。在測定中水中物質(zhì)高于它們?nèi)芙舛葎t不予實(shí)驗。當(dāng)使用一種溶劑（或分散劑）（見章節(jié)1.6.6）時，它的最終濃度不應(yīng)該高于0.1mg/L并且應(yīng)在所在實(shí)驗容器中保持一致。1.7.3 對照實(shí)驗稀釋水的對照實(shí)驗（適當(dāng)濃度）和如有關(guān)的溶劑含量（盡量重復(fù)）的對照實(shí)驗應(yīng)當(dāng)在除實(shí)驗進(jìn)程之外時進(jìn)行。1.7.4化學(xué)分析中測定和測量的頻率在整個實(shí)驗過程中，實(shí)驗物質(zhì)的濃度是由規(guī)定的區(qū)間來決定的。在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗中，希望實(shí)驗物質(zhì)的濃度浮動在標(biāo)準(zhǔn)范圍20%上下（即：在80%120%范圍內(nèi)；見章節(jié) 1

14、.4和1.6）。最低限度要求在新準(zhǔn)備的和即將更新時的最高和最低實(shí)驗濃度要在至少3個不同分開的場合進(jìn)行分析（即：再更新準(zhǔn)備和在更新時，要對相同溶液的試樣進(jìn)行分析）。對于那些實(shí)驗物質(zhì)濃度無法預(yù)計是否在正常范圍內(nèi)20%（在實(shí)驗物質(zhì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上），就必須在新準(zhǔn)備的和即將更新時的最高和最低實(shí)驗濃度進(jìn)行分析，但要保證同一種方法（即：整個實(shí)驗至少平等的在3個平分的區(qū)間）。更新開始時實(shí)驗物質(zhì)濃度的測量需要在重復(fù)的容器內(nèi)每次測量濃度。測量在分開的7天內(nèi)進(jìn)行。要求實(shí)驗實(shí)驗結(jié)果建立在精確的濃度上。盡管如此，如果有適當(dāng)證據(jù)證明，溶液內(nèi)實(shí)驗物質(zhì)濃度很好的穩(wěn)定在標(biāo)準(zhǔn)的或?qū)嶒炄坛鯘舛鹊?0%，那實(shí)驗結(jié)果也可以在標(biāo)準(zhǔn)或精確

15、的初始值上得出。對流通性實(shí)驗，對半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗所描述的類似采樣方式是合適的（但這種情況下“舊的”溶液的測量方法是不適用的）。盡管如此，如果實(shí)驗持續(xù)時間大于7天，在第一周增加采樣場合的數(shù)量（如每3組）來保證實(shí)驗濃度穩(wěn)定是適當(dāng)?shù)?。樣品要被離心或過濾（如用孔徑0.45µm）。盡管如此，然而無論離心還是過濾都不能將實(shí)驗物質(zhì)中非生物適用部分分開，樣品也不必受這些條件約束。在整個實(shí)驗中，溶解的氧氣，pH，溫度要在所在容器中精確測量，對照實(shí)驗中的溫度和最高濃度的容器中總硬度和鹽濃度也要精確測量。至少，溶解的氧氣和鹽濃度要測量3次（開始，中間，結(jié)束）。在半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗中，溶解的氧氣要更精確的測量，最好在每次

16、更新水前后或至少1周1次。硬度則每次實(shí)驗測一次。溫度應(yīng)天天測量且最好在至少1個實(shí)驗容器中繼續(xù)控測。1.7.5 觀測 胚胎生長期盡可能證明胚胎期（如胚囊期）在開始就暴露在實(shí)驗物質(zhì)中。這樣做是為了更好的保養(yǎng)好卵樣品。而幼生期的例子及描述的文獻(xiàn)可在文獻(xiàn)（2）、（5）、（10）、（11）查找到。 孵化和繼續(xù)生存孵化和繼續(xù)生存的觀測每天至少記錄一次，而在實(shí)驗初期（在前3個小時則每30分鐘）提高觀察頻率是可取的，而在一些情況下幸存時間比死亡數(shù)目更有意義（如：有劇烈毒性影響時）。死去的胚胎和幼苗一旦腐爛就要迅速移除。在移除死亡個體時要千萬小心，別碰到附近的卵和幼苗或?qū)ζ湓斐晌锢頁p

17、傷，死亡標(biāo)準(zhǔn)依不同生命階段而改變：對卵： 特別是早期，早期的半透明著色的明顯損失和改變，由蛋白質(zhì)凝固或沉淀導(dǎo)致的白色渾濁（不透光）物。對胚胎：身體移動的終止和心跳消失，及半透明胚胎上有不透光的一系列污點(diǎn)出現(xiàn)對幼苗：靜止不動或呼吸消失，心跳停止或中央神經(jīng)系統(tǒng)有白色不透光污點(diǎn)出現(xiàn)或缺乏對機(jī)械刺激的反應(yīng)。 異常跡象大量幼魚在身體上的色素沉著反常，而卵黃吸收期有足夠的取決于實(shí)驗持續(xù)時間和描述的反?，F(xiàn)象的性質(zhì)所取得區(qū)間被記錄下來。應(yīng)當(dāng)對那些自然出現(xiàn)的反常的胚胎和幼苗小心觀察，也應(yīng)記下對照實(shí)驗中那些規(guī)則的百分比次序。反常的動物死后應(yīng)從容器中移除。 反常行為在由實(shí)驗持續(xù)時間所決定

18、的足夠區(qū)間中，那些反常，如換氣過度、不協(xié)調(diào)的游動和不正常的休眠要記錄下來。這些影響，盡管數(shù)量不同，在觀察時可以增加致死數(shù)據(jù)的說明即提供了實(shí)驗物質(zhì)的毒性反應(yīng)信息。 長度在實(shí)驗結(jié)束，要測量每個個體長度。標(biāo)準(zhǔn)長、股長或全長均可。如果尾鰭腐爛或鰭上有腐蝕，可使用標(biāo)準(zhǔn)長度。一般地，在一個運(yùn)行良好的實(shí)驗中，重復(fù)對照實(shí)驗時長度的系數(shù)變化應(yīng)小于20%。 重量在實(shí)驗結(jié)束，要測量每個個體重量。干重（在60下24小時）比濕重好。一般地，在一個運(yùn)行良好的實(shí)驗中，重復(fù)對照實(shí)驗時重量的系數(shù)變化應(yīng)小于20%。以下這些項目將在一些或全部用來作統(tǒng)計分析：累積死亡率；實(shí)驗結(jié)束后健康幼苗數(shù)；開始孵化和孵

19、化結(jié)束的時間（即：在每個重復(fù)實(shí)驗中有90%孵化）；每天孵化幼苗數(shù)；實(shí)驗殘存者的長度（和重量）；畸形或反常現(xiàn)象的幼苗數(shù)量；展示出反常行為的幼苗數(shù)量。2. 數(shù)據(jù)和實(shí)驗結(jié)果報告2.1 實(shí)驗結(jié)果處理因方法要求考慮實(shí)驗方法的改變?nèi)鐚?shí)驗擴(kuò)展槽的數(shù)量、濃度的數(shù)量、受精卵的數(shù)量和參數(shù)的測定，所以要求一位統(tǒng)計員既計劃實(shí)驗又分析實(shí)驗。由于方案中一些適當(dāng)?shù)倪x擇，特定的關(guān)于統(tǒng)計步驟的指導(dǎo)這里不再給出。如果LOEC/NOEC會被預(yù)估，那對于每組重復(fù)實(shí)驗采用不同的分析方法或偶爾的表格法來變化的進(jìn)行分析是必要的。為了對個體濃度和對照實(shí)驗的實(shí)驗結(jié)果做倍數(shù)比較，可以使用Dunnett的方法（12）、（13）。其他例子也是合適的

20、（14）、（15）。使用ANOVA的可觀察影響的大小或其它步驟（即實(shí)驗的能力）應(yīng)當(dāng)被預(yù)測好并實(shí)驗結(jié)果報告。要注意不足所有在章節(jié)中列出的觀察項目適合用ANOVA做統(tǒng)計分析。例如實(shí)驗結(jié)束時累積致死率和健康幼苗數(shù)量要用概率法分析。如果LC/Ecx被預(yù)先估測。合適的曲線，如類似的計算曲線，適合于使用統(tǒng)計方法如最小二乘法或非線性最小二乘法的數(shù)據(jù)?？梢源_定曲線參數(shù)以明確LC/Ecx并且可以直接指出它的明顯錯誤。而這可以非常容易計算出LC/Ecx周圍的置信限。除非有更好的選擇不同置信水平的原因，應(yīng)引用雙側(cè)置信95%。適當(dāng)?shù)牟襟E能更好的提供一個評估缺乏擬合的重要性，可以使用適當(dāng)曲線的圖解法?；貧w

21、分析對章節(jié)所有觀察物均使用。2.2 實(shí)驗結(jié)果說明實(shí)驗結(jié)果說明要告訴在實(shí)驗溶劑中以分析方法的水平限制下的測量的毒物濃度。對在溶解物質(zhì)的水的上方的濃度實(shí)驗結(jié)果報告說明也要詳細(xì)給出。2.3 實(shí)驗結(jié)果報告實(shí)驗結(jié)果報告必須包括下列信息：2.3.1實(shí)驗物質(zhì)物理性質(zhì)和相關(guān)的物理-化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)鑒別數(shù)據(jù)，包括純度及對合適的實(shí)驗物質(zhì)定量分析的方法；2.3.2實(shí)驗種類學(xué)名，血統(tǒng)，親代魚類的數(shù)目（即實(shí)驗中有多少母魚用來提供所要求的卵），來源，受精卵的收集和隨后的利用。2.3.3實(shí)驗條件習(xí)慣上的實(shí)驗步驟（例如：半穩(wěn)態(tài)實(shí)驗，流通法，受精到實(shí)驗的時間段，裝樣等等）；實(shí)驗方案（例如：實(shí)驗擴(kuò)展槽的數(shù)目，重復(fù)次數(shù)

22、，每次重復(fù)胚胎數(shù)）；繁殖溶液的準(zhǔn)備方法和更新的頻率（溶質(zhì)及其濃度在使用時必須給出）；標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗濃度，測量值，測量方法和明確的容器及方法上的測量誤差，如果實(shí)驗物質(zhì)溶解在水中的濃度小于已測的，要提供涉及到測量實(shí)驗濃度的測量方法。溶劑水的性質(zhì)：pH，硬度，堿度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度，殘余氯元素的級別（如已測），所有含碳有機(jī)物，懸浮的土壤，實(shí)驗環(huán)境的含鹽量和其他可測定的物質(zhì)；容器水的性質(zhì)：pH，硬度，溫度，水中溶解的氧氣的濃度；2.3.4實(shí)驗結(jié)果從實(shí)驗物質(zhì)穩(wěn)定性初步得到的實(shí)驗結(jié)果所有可接受的可對照的標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗魚種證明（附件2、3）；每日胚胎和幼蟲死亡率/幸存者和全部的死亡率/生還率數(shù)據(jù)；孵化天數(shù)和

23、孵化數(shù)目的數(shù)據(jù)；重量和長度的數(shù)據(jù)；畸形發(fā)生率及其描述；統(tǒng)計分析和數(shù)據(jù)處理；對使用ANOVA分析的實(shí)驗，對每個預(yù)估反應(yīng)在p=0.05時的LOEC和NOEC，包括使用的統(tǒng)計步驟的描述和那些初查出影響的程度的跡象；對用回歸分析的實(shí)驗，LC/Ecx和置信區(qū)間和適合計算的曲線模型。3參考文獻(xiàn)：(1) Kristensen P. (1990) Evaluation of the Sensitivity of Short Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the C

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39、 trout(9)(16) 虹鮭Danio rerioZebrafish(7)(17)(18) 斑馬魚Cyprinus caprioCommon carp(8)(19) 鯉魚Oryzias LatipesJapanese ricefish/medaka(20)(21)PimepHaLes promeLasFathead minnow(8)(22)表格 1B 一些其它文獻(xiàn)曾用過的種類淡水咸水Carassius auratus金魚Menidia peninsuLae潮水 最好的牛腿肉(23)(24)(25) Lepomis macrochirus淺藍(lán)色食用大太陽魚CLupea harengus鯡魚

40、（24）（25）Gadus morhua鱈 (24)（25）Cyprinodon variegatus紅鱸 鯉科小魚(23)(24)(25) 附件 1在一個毒性測定對胚胎及 SACFRY 的表現(xiàn)方面的指導(dǎo)引言斑馬魚起源于印度 Coromandel 海岸高速流動的河流中。它是鋰魚家族一類通常的水族館魚，有關(guān)它培育和照料方式的信息能在熱帶魚的權(quán)威參考書中查到。LaaLe曾研究過它在漁場研究方面的理論和應(yīng)用（1）。魚體長度很少超過 45 毫米。魚體是圓柱形并帶有7到9條深藍(lán)色的斑紋，與銀色相間，這些斑紋延伸到尾部至尾鰭處。 背部是橄欖綠色。雄性較雌性個體為小。而雌性更帶銀色的，且腹部更大, 顯然這有

41、利于產(chǎn)卵。成魚能夠忍受溫度， pH 和水硬度的較大變動。 然而,為了使魚體健康而產(chǎn)出高質(zhì)量的卵,應(yīng)提供最佳的生存條件。在發(fā)情期間雄魚四處找尋雌魚然后以頭對著雌魚, 這樣當(dāng)卵產(chǎn)下后便已受精。卵是透明的，且彼此是相互獨(dú)立的, 當(dāng)它們沉到底部時就有可能被父母吃掉。產(chǎn)卵受陽光影響。如果早晨陽光足夠的話,雌魚通常會在黎明之后的幾小時就產(chǎn)卵。每只雌魚一次可產(chǎn)下幾百粒卵，每兩次產(chǎn)卵間隔一個星期。親代魚的情況,繁殖及早期發(fā)育階段選擇適當(dāng)數(shù)量健康的魚，然后讓這些魚在條件適宜的水中(例：附4)生活，要求在預(yù)計的產(chǎn)卵期前必須生活至少2周以上。這批魚在本次研究以前必須至少產(chǎn)過一次卵。魚群的密度在此期間不得超過1克每升

42、。在有規(guī)律的換水或是水體凈化可以允許種群密度高一點(diǎn)。培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)該維持在25±2，并提供各種各樣的魚食，例如，適當(dāng)?shù)纳唐沸愿墒澄铮蚴切迈r的 hatched Arthemia, chironomids(搖蚊),Daphnia（水蚤），白色蚯蚓(Enchytraeids)。兩個過程在下面有所描述, 這導(dǎo)致有一批健康的受精卵以保證測定：8條雌魚和16條雄魚同放在一個包含50升已稀釋培養(yǎng)液的桶里,避免受陽光直射且盡可能不受打擾的保持至少48個小時。在開始測定的前一天下午把一個產(chǎn)卵托盤放在魚缸的底部。這個產(chǎn)卵托盤由plexi-glass(聚異丁烯酸樹脂)或其它合適的材料組成一個框架，5到7

43、cm高，一個2到5mm的粗糙的網(wǎng)連到頂部，同時一個10到30微米的網(wǎng)在底部。大量由解開的尼龍繩組成的產(chǎn)卵樹附在那個粗糙的網(wǎng)上。當(dāng)魚已被留在黑暗中12個小時之后，一束微弱的光線就會導(dǎo)致開始產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后二到四個小時，移開產(chǎn)卵托盤并收集產(chǎn)的卵。產(chǎn)卵托盤作用在于可以防止父母吃掉卵同時使收集這些卵變得容易。這些產(chǎn)卵的魚在用于本次實(shí)驗前必須至少已產(chǎn)過一次卵。在預(yù)產(chǎn)期前至少兩周把5到10條雄魚和雌魚隔離放置。5到10天后，雌魚的腹部變大而且可以看到它們的生殖器乳頭。雄魚則沒有乳頭。產(chǎn)卵就在這個底部裝有偽裝網(wǎng)（如上所說）的產(chǎn)卵缸內(nèi)進(jìn)行。這個產(chǎn)卵缸裝滿了作為溶劑的水，因此在底部網(wǎng)以上的水深為5到10cm在預(yù)產(chǎn)期

44、前一天把一條雌魚和兩條雄魚放在缸里面，控制水溫在最適合溫度再高一度。屏蔽所有的光線并把缸放在盡量不受打擾的地方。早上的一絲光線就會誘發(fā)產(chǎn)卵。2到4小時后，移開魚并收集卵。如果卵的需求量很大，一條雌魚產(chǎn)的不夠多的話，就應(yīng)該同時培養(yǎng)幾個產(chǎn)卵缸。通過記錄這些優(yōu)于測定（數(shù)量和質(zhì)量）的成功產(chǎn)卵經(jīng)歷，這些有著高產(chǎn)卵成功率的雌魚就會被挑選出來飼養(yǎng)。這些卵會被轉(zhuǎn)移到一個由玻璃管（內(nèi)徑不小于4mm)組成的測定容器里,并提供一個柔和的抽氣球。在測定容器內(nèi)的水要盡可能的少。卵密度比水的大因此會下沉而落出管子，此時要小心注意不讓卵（以及幼蟲）接觸空氣。在這些卵中作抽樣微型試驗來保證在這第一個發(fā)育的階段里面所有卵都是一

45、樣好的。對這些卵不準(zhǔn)消毒。在受精后的24小時里卵的死亡率是最高的，一般會達(dá)到5%到40%。如果卵腐敗就代表受精或發(fā)育失敗。一批卵的質(zhì)量看起來似乎是由雌魚決定的，因為一些雌魚總是產(chǎn)下高質(zhì)量的卵，而另一些卻相反。同樣發(fā)育率和孵化率也是因雌魚不同而異。成功的受精卵以及卵黃囊幼蟲發(fā)育得好，一般可達(dá)到90%。在25攝氏度時受精卵會孵化3到5天然后卵黃囊會在受精后的約13天里被吸收。Hisaoka 和 BattLe（2）曾對胚胎的發(fā)育作過詳細(xì)的定義。從卵和發(fā)育幼蟲的透明度可以看出哪些會發(fā)育成為魚以及哪些會發(fā)育為畸形。大約在產(chǎn)卵后4小時，未受精的卵就可以從受精卵中區(qū)別出來（3）。因為這個原因，卵和幼蟲會被放

46、置到一個小容量的測定器皿里面，這樣就可以用顯微鏡來觀察。早期發(fā)育階段的試驗條件，在附錄2里列出。理想的試驗環(huán)境的pH值和水硬度分別是7.8和250 mg CaCO3/L 。計算和統(tǒng)計建議分兩步進(jìn)行。第一，死亡率，畸形發(fā)育和孵化時間應(yīng)被統(tǒng)計分析。然后，在那些對上述統(tǒng)計項沒有任何影響的濃度上，魚體的平均長度可以通過統(tǒng)計求出。這個步驟是可取的，因為毒素可以有選擇性的殺死小魚，延遲孵化時間并使畸形魚量增大，因此導(dǎo)致平均魚體長度的測量值偏差。此外，每次測量的魚數(shù)目相同，這樣也保證了統(tǒng)計數(shù)值的有效性。LC50 及 EC50 定義平安生存下來卵和幼蟲的百分比和修正后的死亡率符合 Abbott 公式(4)：其

47、中 修正后的存活率 試驗中集中觀察到的存活率C 控制下的存活率如果可能的話, 在試驗結(jié)束的時候LC50 已被一個適當(dāng)?shù)姆椒Q定。如果在EC50 的統(tǒng)計中試驗的畸形率與期望值差不多，可在StepHan(5)中得到指導(dǎo)。LOEC 和 NOEC估計一個客觀的卵和 sac-fry試驗是為了與受控的非零集中相比較，即決定了LOEC.因此多方面的比較方式應(yīng)被采用。參考文獻(xiàn)(1) Laale H.W. (1977) The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio rerio) inFisheries Research. A Literature Revie

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