當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后PTEN的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)分析

1、當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后PTEN的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)分析【摘要】 目的：探討當(dāng)歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞PTEN的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方法:將35只SD大鼠隨機(jī)分成4組(n=10):正常對照組(n=5);假手術(shù)組(n=10);缺血再灌注組(n=10);當(dāng)歸治療組(n=10) ,建立在體心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)完畢后，將各組動(dòng)物心肌組織做免疫組織化學(xué)染色;觀察各組動(dòng)物心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN表達(dá)的變化。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定PTEN在以上各組中表達(dá)的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：正常對照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見

2、少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達(dá)呈陽性;當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性。圖像分析結(jié)果顯示：正常對照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間PTEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡有重要的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸注射液; 缺血再灌注; 心肌;

3、 細(xì)胞凋亡; PTEN心肌缺血再灌注損傷( ischemia / reperfusion, I/R), 是指在短時(shí)間心肌血供中斷, 一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血供, 原缺血心肌發(fā)生較血供恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷。隨著心臟外科體外循環(huán)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、復(fù)雜先天性心臟病糾治術(shù)、及溶栓等治療的推廣應(yīng)用, 已成為阻礙心血管治療療效的主要難題1。近年,中草藥在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到越來越多的關(guān)注, 中草藥舒張冠狀血管、改善冠脈循環(huán), 減輕氧化損傷等均是其發(fā)揮心臟保護(hù)作用的重要機(jī)制2。當(dāng)歸為傘形科(Umbrelliferae)植物的干燥塊根,藥性甘、辛、溫,入肝、心、脾經(jīng), 具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸等功效3

4、，4。當(dāng)歸屬于和血類藥物(指有養(yǎng)血、調(diào)和血脈作用的藥物) 。近年來，有不少學(xué)者對中藥預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行了研究與探索。PTEN 基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶(DPS) 活性的抑癌基因,該基因在細(xì)胞的生長、增殖、遷移和細(xì)胞凋亡中具有重要的生物學(xué)功能5。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)方法觀察當(dāng)歸注射液對缺血/再灌注過程心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá),探討當(dāng)歸注射液對心肌缺血/再灌注損傷的作用機(jī)理。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物模型制備及分組 選用健康雄性Wistar大鼠(SPF級)35只,體重250300g左右。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg·(100

5、g)-1,麻醉動(dòng)物后行氣管切開接微型呼吸機(jī)人工呼吸呼吸頻率60 次·min-1, 潮氣量2ml·(100g)-1,沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開放左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動(dòng)物隨機(jī)分成4組: 正常對照組(不做任何處理);假手術(shù)組(絲線穿過冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎);缺血再灌注損傷組(IR)( 缺血/ 再灌注前靜脈注射生理鹽水0.8ml / kg，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支45min ,再灌注120 min );當(dāng)歸注射液預(yù)處理組(在結(jié)扎前20min，靜脈注射當(dāng)歸注射液0.8ml/ kg , 其它處理同缺血/ 再灌注組)。1.2 主要試

6、劑25%當(dāng)歸注射液(武漢大學(xué)中南醫(yī)院制藥廠);即用型兔抗鼠Bim多克隆抗體，即用型SP通用型免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色試劑盒及多聚賴氨酸。以上試劑均購于北京中山生物技術(shù)有限公司。1.3 方法1.3.1 常規(guī)HE染色 取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色。1.3.2 免疫組織化學(xué)SP法檢測PTEN相關(guān)抗原 主要步驟：5m組織切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫處理10 min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性，Ki67均采用高壓抗原修復(fù)，正常羊血清處理10 min以減少非特異性背景，一抗4孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗處理10 min，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物處理10min，DAB顯色液

7、顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS代替一抗作為陰性對照組。1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷PTEN以胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。陰性對照組除細(xì)胞核染成藍(lán)色外，應(yīng)無棕黃色反應(yīng)物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對PTEN抗原的表達(dá)進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對各組免疫組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)

8、為0.05。2 結(jié)果PTEN的表達(dá) 正常對照組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;假手術(shù)組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性;缺血再灌注損傷組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見大量的棕黃色顆粒沉積，PTEN表達(dá)呈陽性;當(dāng)歸治療組：心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量和未見棕黃色顆粒，PTEN表達(dá)呈陰性。圖像分析結(jié)果顯示：正常對照組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.1925±0.0011，假手術(shù)組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.2013±0.0024，缺血再灌注損傷組：PTEN表達(dá)的平均光密度為0.8974±0.0086;當(dāng)歸治療組：PTEN表達(dá)的表達(dá)的平均光密度為

9、0.2183±0.0038;正常對照組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.2038±0.0023，假手術(shù)組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.2159±0.0026，缺血再灌注損傷組：PTEN表達(dá)的陽性面積率為0.9631±0.0077;當(dāng)歸治療組：PTEN表達(dá)的表達(dá)的陽性面積率為0.2485±0.0048。經(jīng)單因素方差分析，各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)。經(jīng)q 檢驗(yàn)，正常對照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間PTEN的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術(shù)組之間

10、、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間PTEN平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。表1 當(dāng)歸注射液對大鼠心肌缺血再灌注損傷后各組PTEN表達(dá)的平均光密度和陽性面積率注：* 正常對照組、假手術(shù)組、當(dāng)歸治療組與缺血再灌注損傷組比較，P<0.001; 當(dāng)歸治療組、假手術(shù)組與正常對照組比較，P>0.05。3 討論近年來,心血管疾病已成為威脅人類生命的主要原因,而心肌梗死的發(fā)病率亦呈上升趨勢。眾所周知,早期溶栓治療是心肌梗死較為理想的治療手段,它可以挽救缺血的心肌細(xì)胞,減少梗死面積,改善心臟功能。但溶栓造成的再灌注損傷也愈來愈引起臨床醫(yī)務(wù)工作者

11、的關(guān)注。長時(shí)間心肌缺血可造成組織損傷和細(xì)胞死亡,早期的再灌注可挽救缺血組織,但仍能造成細(xì)胞繼續(xù)死亡,這種再灌注給組織帶來的負(fù)性影響被稱為再灌注損傷6。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),于大鼠短暫缺血30min后進(jìn)行觀察,未見凋亡細(xì)胞數(shù)量增多。而再灌注240min于缺血的左室壁,發(fā)現(xiàn)有大量的心肌細(xì)胞凋亡出現(xiàn)。證實(shí)存在再灌注心肌細(xì)胞的損傷,且在短暫缺血后再灌注心肌細(xì)胞死亡主要為細(xì)胞凋亡。提示心肌細(xì)胞凋亡是心肌再灌注損傷的特征之一,可能與再灌注心肌遲發(fā)性死亡密切相關(guān)7,8。當(dāng)歸是傳統(tǒng)中藥,可對缺血心臟冠脈血管有明顯的擴(kuò)張作用,促進(jìn)心肌側(cè)枝循環(huán)的建立,改善心肌血流分布,減輕因缺血再灌注引起的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)

12、歸對細(xì)胞凋亡有防治作用。在再灌注前給藥,可明顯減少再灌注引起的細(xì)胞凋亡,并證明當(dāng)歸對心肌缺血的保護(hù)點(diǎn)在再灌注期,這將當(dāng)歸的研究提高到分子生物學(xué)水平9，10。PTEN 基因全長200 kb ,有9個(gè)外顯子,mRNA長度為5.5 kb ,cDNA 序列內(nèi)有一個(gè)由1209 個(gè)核苷酸組成的開放閱讀框,編碼由403個(gè)氨基酸殘基組成蛋白。免疫熒光顯示,PTEN 蛋白定位于胞漿中,具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶活性,能使某些磷脂或蛋白激酶相應(yīng)位點(diǎn)去磷酸化,抑制細(xì)胞周期的運(yùn)行,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移和分化1113。PTEN 因其獨(dú)特的作用途徑而倍受關(guān)注,它作為第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因,具有抑制

13、生長、促進(jìn)凋亡、參與細(xì)胞周期的調(diào)控、抑制血管生成及抑制細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移的作用14，15。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明: 正常對照組：PTEN表達(dá)較低;假手術(shù)組：PTEN表達(dá)較低;缺血再灌注損傷組：PTEN表達(dá)高;當(dāng)歸治療組：PTEN表達(dá)較低。圖像分析結(jié)果顯示：正常對照組、當(dāng)歸治療組、 假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間PTEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01);正常對照組與假手術(shù)組之間、當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組之間PTEN表達(dá)的平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05) 。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示: 心肌I/ R 損傷可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡, 當(dāng)歸能對缺血心臟冠脈

14、血管有明顯的擴(kuò)張作用,促進(jìn)心肌側(cè)枝循環(huán)的建立,改善心肌血流分布, 可明顯減少再灌注引起的細(xì)胞凋亡，對心肌細(xì)胞起了重要的保護(hù)作用。【參考文獻(xiàn)】 1 楊勇, 賈國良. 左旋卡尼汀對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 25 (2) : 134137.2 李貴榮,呂昌銀,楊勝圓. 當(dāng)歸多糖清除活性氧自由基作用的研究. 南華大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,16(3):1820.3 陳江弘,楊崇仁.當(dāng)歸屬植物的研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2004 ,16 (4): 359365.4 李用珍,劉彩紅,董紅軍.當(dāng)歸化學(xué)成分研究.實(shí)用中醫(yī)藥雜志,2004 ,20(2):1051

15、06.5 陳國庭, 尹浩然, 朱正剛. PTEN基因的研究進(jìn)展. 國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊, 2001, 24: 7173.6 Ji ES ,Yue H ,Wu YM, et al . Effects of phytoestrogen genistein on myocardial ischemia/ reperfusion injury and apoptosis in rabbits. ActaPharmacol Sin, 2004, 25(3):306312.7 Ji ES ,Yue H ,Wu YM, et al . Effects of phytoestrogen genistein on

16、 myocardial ischemia/ reperfusion injury and apoptosis in rabbits. ActaPharmacol Sin, 2004, 25(3):306312.8 王雨. 缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2002 ,9 (1) :6164.9 龍全江,徐茂保,趙海鷹. 當(dāng)歸油炒前后揮發(fā)油化學(xué)成分對比研究.中國中藥雜志, 2007,31 (24) :20852087.10 張翠蘭,文德鑒.當(dāng)歸對血液及造血系統(tǒng)藥理作用研究進(jìn)展.湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)·醫(yī)學(xué)版,2002,19(4):3436.11 Weng L, B rown

17、 J, Eng C. PTEN induces apop tosis and cell cycle arrest through phosphoinositol3kinase / Akt dependent andindependent pathways. HumMol Genet,2001, 10(3):237242.12 Tamura M, Gu J, Matsumoto K, et al. Inhibition of cell migration, sp reading, and focal adhesions by tumor supp ressor PTEN. Science, 1998, 280 (5369):1614 1617.13 TanakaM, KoulD,DaviesMA, et al. MMAC 1 /PTEN inhibits cell growth and induces chemosensitivity to doxorubicin in human bladder cancer cells. Onco gene, 2000, 19 (47):54065412.14 Mutter GL, L in MC, Fitzgerald JT, et al. Altered PTEN expression as a diagnost