恒河猴CD1d基因的克隆及其組織表達(dá)差異性分析

1、恒河猴CD1d基因的克隆及其組織表達(dá)差異性分析 作者：張萍, 周慧芳, 孫正華, 邵曉麗, 張華堂, 徐小寧【摘要】 目的: 克隆非人靈長(zhǎng)類疾病動(dòng)物模型恒河猴的CD1d基因并檢測(cè)其在不同組織中的表達(dá)差異情況。方法: 提取恒河猴血液及各組織的RNA, 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板, 用特異性引物擴(kuò)增CD1d; 以管家基因GAPDH為內(nèi)參, 用半定量RTPCR的方法對(duì)CD1d的組織表達(dá)差異性進(jìn)行分析。結(jié)果: 成功擴(kuò)增了恒河猴CD1d基因的編碼區(qū)序列; 首次用半定量RTPCR的方法檢測(cè)了CD1d mRNA在恒河猴部分組織中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平存在明顯的組織差異性, 其中, 在肝臟、 脾臟和心

2、臟中的表達(dá)水平較高, 在血液、 小腸和肺中次之, 在腦中表達(dá)最少。結(jié)論: 研究結(jié)果為今后表達(dá)恒河猴CD1d蛋白并制備其四聚體進(jìn)而研究恒河猴NKT細(xì)胞在眾多疾病中的作用奠定了基礎(chǔ); 組織表達(dá)差異的研究結(jié)果提示其在相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演著重要的角色, 具體作用還有待深入研究。 【關(guān)鍵詞】 CD1d; NKT細(xì)胞; 恒河猴; 組織分布 Abstract AIM: To amplify the CD1d and analyze its tissue distribution in Rhesus macaque. METHODS: Extracting total RNA from diffe

3、rent tissues of Rhesus macaque. CD1d amplification was carried using specific primers and tissue distribution was analyzed by semiquantification RTPCR, using the housekeeping gene GAPDH as an internal control. RESULTS: The CD1d coding region was obtained in this experiment and tissue distribution wa

4、s analyzed: a highest level of CD1d expression was detected in heart, liver and spleen, lower level in blood, lung, small intestine and stomach, and least in brain. CONCLUSION: The successful amplification of CD1d is useful to produce antiCD1d antibody and CD1dtetramer to study NKT cells in Rhesus m

5、acaque. The expression pro CD1d mRNA in Rhesus macaque is in accordance with the tissue distribution and the functions of NKT cells in other species. These results will provide important insights for future research on the relationship of CD1d/NKT cells and their roles in different tissues. Keywords

6、CD1d; NKT cells; Rhesus macaque; Tissue distributionCD1家族是一類非經(jīng)典的抗原遞呈分子, 包括CD1a、 b、 c、 d和e 5個(gè)成員, 其中CD1 a、 b、 c和e屬于第組, CD1d屬于第 組。在靈長(zhǎng)類中兩類CD1分子均有表達(dá), 但在小鼠等嚙齒類動(dòng)物中僅表達(dá)CD1d, 稱為CD1d 11。CD1家族成員在進(jìn)化中表現(xiàn)的非常保守。與經(jīng)典的抗原遞呈分子MHC結(jié)構(gòu)類似, CD1d分子也包括胞膜外區(qū)（ 13）、 跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū), 并通過(guò)重鏈3結(jié)構(gòu)域與2m非共價(jià)結(jié)合形成異源二聚體發(fā)揮抗原遞呈的功能; 與MHC不同的是, CD1d遞呈的是脂類抗原,

7、 而非肽類抗原。作為抗原遞呈分子, CD1d可以將外來(lái)或自身的脂類抗原遞呈給CD1d限制性的NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞是一類數(shù)量很少但很重要的免疫細(xì)胞, 在細(xì)胞免疫和體液免疫中均起重要作用2。鑒于NKT細(xì)胞表現(xiàn)出的CD1d限制性, 承載GalCer（一種從海綿中提取的鞘糖脂）的CD1d四聚體已經(jīng)成為檢測(cè)和認(rèn)定NKT細(xì)胞的關(guān)鍵性標(biāo)記之一3, 因此, 克隆并表達(dá)功能性的CD1d已經(jīng)成為研究NKT細(xì)胞的重要環(huán)節(jié)。 目前, 許多物種的CD1d基因序列已經(jīng)得到了公布, 其編碼區(qū)長(zhǎng)度在不同物種中稍有差別, 人的CD1d基因編碼區(qū)全長(zhǎng)有1 008 bp, 恒河猴為1 014 bp, 小鼠CD1d 為1 011

8、bp。盡管如此, 不同物種間CD1d的同源性及功能上均表現(xiàn)了高度的保守性。有研究表明, CD1d分子主要表達(dá)在脾細(xì)胞、 樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和胃腸道上皮細(xì)胞上。Canchis等4曾通過(guò)免疫組化染色方法檢測(cè)到人的CD1d在小腸、 肝臟、 胰臟、 腎臟、 胃以及皮膚等組織中均有表達(dá)。Kasai等5結(jié)合原位雜交及免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在大鼠的脾臟、 胸腺、 肝臟、 肺、 心臟、 腎臟、 小腸等組織中均有CD1d 1的表達(dá)。但尚未見(jiàn)到關(guān)于恒河猴的CD1d組織表達(dá)差異情況的詳細(xì)報(bào)道。本試驗(yàn)中, 我們對(duì)人類疾病發(fā)生和治療等研究中被廣泛應(yīng)用的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型恒河猴的CD1d分子進(jìn)行了克隆和研究。成功克隆了恒河猴的

9、CD1d編碼區(qū)序列, 并首次用半定量RTPCR的方法檢測(cè)了部分組織中CD1d的表達(dá)情況, 為今后研究CD1d/NKT細(xì)胞的分布及其在不同組織中的功能特點(diǎn)給出了提示。 1 材料和方法 1.1 材料 恒河猴各組織總RNA由昆明動(dòng)物研究所比較基因組學(xué)研究組提供; rTaq聚合酶 (DR001A)、 DNA Marker DL 2 000 (D501A)、 pMD19T（D102A）載體、 及其他生化常用試劑購(gòu)自TaKaRa公司; 大腸桿菌DH5為中科院昆明動(dòng)物研究室免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備并保存; RNAprep培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒 （DP430）、 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 （DP21402）、 p

10、fu高保真聚合酶 （EP10101）、 TIANscript MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶 （ER10404）購(gòu)自Tiangen公司; iCyclerTM Thermal Cycler PCR儀購(gòu)自BioRad公司; Sal I （ER0641）和BamH I （ER0051）內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司。 1.2 方法 1.2.1 組織cDNA模板的獲得 取10 L總RNA(約5 g), 按TIANscript MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄: 加入2 L dNTP (10 mol/L)和2 L oligo (dT)引物(10 mol/L), 混勻后70反應(yīng)5 min; 冰上冷卻, 加入1 L

11、DTT, 4 L 5×First Strand Buffer, 混勻, 42反應(yīng)2 min; 加入1 L反轉(zhuǎn)錄酶 MMLV (200 U), 42反應(yīng)50 min; 最后95放置5 min終止反應(yīng)即得到第1鏈cDNA。 1.2.2 基因的擴(kuò)增、 質(zhì)粒的構(gòu)建、 提取及鑒定 根據(jù)GenBank中恒河猴CD1d序列（NM_001033114）設(shè)計(jì)引物（表1）, 利用恒河猴血液的cDNA作模板進(jìn)行擴(kuò)增; 同時(shí)用管家基因GAPDH作為參照進(jìn)行CD1d基因在各組織中表達(dá)差異性的半定量分析。用pfu高保真酶進(jìn)行CD1d擴(kuò)增的條件為: 50 L反應(yīng)體系, 96預(yù)變性4 min, 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)（95

12、變性30 s, 55退火30 s, 72延伸2 min）, 最后72充分延伸10 min。擴(kuò)增完成后將產(chǎn)物進(jìn)行加A處理: 50 L產(chǎn)物中加2 L dNTP和1 L rTaq, 72反應(yīng)40 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 得到預(yù)期長(zhǎng)度的片段后割膠回收, 然后連入pMD19T載體, 轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài), 菌液涂到含Amp的LB平板上, 37過(guò)夜培養(yǎng), 隨機(jī)挑取長(zhǎng)出的克隆搖菌, 12 h后提質(zhì)粒; 提出的質(zhì)粒用Sal I和BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定, 鑒定正確的克隆送去測(cè)序, 進(jìn)一步確認(rèn)所得到的產(chǎn)物是恒河猴的CD1d基因。 1.2.3 恒河猴CD1d mRNA的組織表達(dá)差異性分

13、析 以管家基因GAPDH為參照, 用半定量RTPCR的方法檢測(cè)恒河猴不同組織中CD1d mRNA的表達(dá)水平。表1 擴(kuò)增人和恒河猴的CD1d全長(zhǎng)基因及GAPDH片段的引物 2 結(jié)果 2.1 恒河猴的CD1d基因的擴(kuò)增 以人和恒河猴的血液cDNA為模板, 用如表1中設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增人和恒河猴的CD1d基因編碼區(qū), 經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)我們得到的片段長(zhǎng)度為1 000 bp左右, 與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。 2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后連入pMD19T載體, 轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài), 涂含Amp的LB平板, 挑取長(zhǎng)出的克隆搖菌, 12 h后提質(zhì)粒并用Sal I和BamH

14、 I進(jìn)行雙酶切鑒定, 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)所提的重組質(zhì)粒中確實(shí)含有1 000 bp左右的插入片段（圖2）。 為進(jìn)一步確認(rèn)所得到的片段確為恒河猴CD1d基因, 我們將初步鑒定正確的克隆送出測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示, 我們得到的片段為1 014 bp, 經(jīng)BLAST序列比對(duì)顯示該序列與GenBank中恒河猴的CD1d序列一致編碼336個(gè)氨基酸, 用EditSeq軟件預(yù)測(cè)其蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為37 861, 說(shuō)明我們成功獲得了恒河猴CD1d的編碼區(qū)序列, 為今后表達(dá)該蛋白和研究該分子的功能奠定了基礎(chǔ)。 2.3 恒河猴CD1d mRNA的組織表達(dá)分布情況的初步分析 以恒河猴血液及各組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的c

15、DNA為模板, 用管家基因GAPDH (669 bp)為參照對(duì)不同組織中CD1d（1 014 bp）的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)（圖3）, 結(jié)果表明, 檢測(cè)的各組織中均有CD1d mRNA的表達(dá), 但以心臟、 肝臟和脾臟中表達(dá)最多, 小腸、 血液、 肺和胃中的表達(dá)相對(duì)較少, 腦中CD1d的表達(dá)水平最低。 3 討論 Canchis等利用免疫組化和原位雜交的方法檢測(cè)了人和大鼠中的CD1d在各組織中的表達(dá)情況4, 5, 而恒河猴CD1d的組織表達(dá)譜至今還沒(méi)有研究報(bào)道。本試驗(yàn)中, 我們利用半定量RTPCR的方法對(duì)恒河猴CD1d mRNA在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn), CD1d在心臟、 肝臟和脾臟

16、中表達(dá)水平最高, 血液、 小腸、 肺和胃中相對(duì)較少, 腦中CD1d的表達(dá)水平最低, 這種表達(dá)模式與以往關(guān)于CD1d/NKT細(xì)胞的研究比較吻合。眾所周知, 肝臟承載著機(jī)體的新陳代謝和固有免疫等重要功能。研究證明, 肝臟中NKT細(xì)胞的比例是最多的, 而且CD1d/NKT細(xì)胞在抵抗HBV感染和發(fā)病、 肝細(xì)胞腫瘤免疫等方面都發(fā)揮著重要的作用6, 因此, 我們推測(cè)恒河猴肝臟中CD1d高表達(dá)的現(xiàn)象可能與NKT細(xì)胞在肝臟中抗病毒感染等免疫功能相關(guān), 這給我們一定的提示, 有助于進(jìn)一步研究肝臟NKT細(xì)胞的功能, 也提示我們可以利用CD1d限制性制備針對(duì)NKT細(xì)胞的相關(guān)疫苗來(lái)防治肝臟腫瘤和病毒感染性疾病。NKT

17、細(xì)胞在自體免疫反應(yīng)和免疫耐受等疾病中也有重要影響, 研究表明, 脾外周B細(xì)胞高水平表達(dá)的CD1d分子及其活化的NKT細(xì)胞可以抑制1型糖尿病的發(fā)生7。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也驗(yàn)證了在恒河猴脾組織中能檢測(cè)到高表達(dá)的CD1d, 借此結(jié)果, 我們可以進(jìn)一步研究脾中的NKT細(xì)胞與1型糖尿病的關(guān)系, 從而找到治療1型糖尿病的方法。另外, 研究發(fā)現(xiàn), 巨噬細(xì)胞表達(dá)的CD1d所活化的NKT細(xì)胞會(huì)聚集到心臟的發(fā)炎部位8, 而本研究中我們又證明恒河猴的心臟中CD1d的表達(dá)水平較高, 可以推測(cè)其與心臟相關(guān)疾病的免疫是密切相關(guān)的。 CD1d和NKT細(xì)胞對(duì)于機(jī)體抗感染及抵抗病毒感染等具有重要作用, 但其機(jī)理和具體的分子機(jī)制尚不明

18、確, 需進(jìn)一步的研究和補(bǔ)充。本實(shí)驗(yàn)中得到了恒河猴CD1d在不同組織中的表達(dá)差異情況, 與以往的研究結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性, 提示我們可以以恒河猴為動(dòng)物模型深入研究其CD1d分子與NKT細(xì)胞的關(guān)系和相互作用, 并研究NKT細(xì)胞在不同組織中的免疫功能, 進(jìn)而為相關(guān)疾病的治療, 抗病毒感染及抗腫瘤免疫等研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)。 致謝: 感謝中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所比較基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的恒河猴組織RNA; 感謝試驗(yàn)過(guò)程中李德敏老師提供的幫助和建議?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Brossay L, Kronenberg M. Highly conserved antigenpresenting function of

19、CD1d moleculesJ. Immunogenetics, 1999, 50(3): 146-151.2 Taniguchi M, Seino K, Nakayama T. The NKT cell system: bridging innate and acquired immunityJ. Nat Immunol, 2003, 4(12): 1164-1165.3 Li D, Chen N, McMichael AJ, et al. Generation and characterisation of CD1d tetramer produced by a lentiviral expression systemJ. J Immunol Methods, 2008, 330(1-2): 57-63.4 Canchis PW, Bhan AK, Landau SB, et al. Tissue distribution of the nonpo