[精品]基因工程復習重點

1、基因工程的概念：利用 DNA體外重組或 PCR擴增技術從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分了，再將其轉入適當的受體細胞，以期獲得基因表達的過程同裂酶（isoschizomer）來源于不同的生物，能識別相同順序的限制酶同尾酶（isocaudamer）有些限制酶識別序列不同，但切割產生的末端是相同的Klenow片段：用枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大腸桿菌 DNA聚合酶I而得到的該酶的大片段，稱為 Klenow片段分子克隆載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞的DNA分子。哺乳動物人工染色體

2、 （MAC ）:哺乳動物人工染色體指從哺乳動物細胞中分 離出 復制 起始區(qū)、端 粒以 及著 絲粒構 建而 成的 克隆 載體。它可 以克隆大 于OOOkb的外源DNA片段。酵母雜交系統載體：一類載體中存在一個DNA-結合序列（BD ），它與已知的釣餌序列融合；另一類載體則含有基因表達激活序列（AD ），它則與未知或已知的捕獵序列融合。細菌人工染色體 （BAC BAC:是基于大腸桿菌的 F質粒構建的，高通量低拷貝的質粒載體。每個環(huán)狀DNA分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來源于大腸桿菌F因子（致育 因子）的嚴謹型控制的復制子 oriS （ Shizuyaetal. 1992 ）, 一個易于 DNA

3、復制的山 ATP驅動的解旋酶（RepE）以及三個確保低拷貝質粒精確分配至子代細胞的基因座（parA, parB ,和parC ）。裝載片段 100 300kb。Pl人工染色體載體（PAC P1噬菌體載體的改造，結合了 P1噬菌體載體和BAC載體的 優(yōu)點。克隆外源片斷130-150kb酵母菌人工染色體 （YAC）廣泛用于構建高等動植物基因組文庫的構建，山YLp經適當改造 后構 建成pYAC載體。裝載片段為 200 500kb。DNA寡核昔酸或 DNA片段（稱 為探DNA芯片技術：DNA芯片（或基因芯片）是將許多特定的針）固定在芯片的每個預先設置的區(qū)域內，將待測樣本標記后同芯片進行雜交分析，利用堿

4、基互補配對原理進行雜交，通過檢測雜交信號并進行計算機分析，從而檢測對應片段是否存在、存在量的多少，以及用于基因的功能研究和基因組研究、疾病的臨床診斷和檢測等眾多方面基因組文庫：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分了的克隆總和cDNA文庫：從一定生長階段或條件的某種細胞分離到的全部mRNA經反轉錄成cDNA后再重組和增殖所產生的無性繁殖系的總和 限制性內切酶的識別特點：11絕大多數酶的識別序列是特異的，僅有少數有變動【2】識別序列一般為 4? 6個堿基對，一般都富含GC【3】大多數識別序列具有180。旋轉對稱的回文結構（Palindrome ）限制性內切酶的切割方式：【1】切點大多數在識別順序

5、之內【2】少數在識別順序之外DNA經限制酶切后，產生2種類型的末端：粘性末端（ sticky end ）和平整末端（blunt end）限制酶反應條件： DNA（DNA的純度與甲基化程度）、限制酶、反應緩沖液（ Tris-Cl、NaCl、 Mg2+ ）、反應時間與溫度：限制酶星反應：在變化的條件下，限制酶識別序列特異性降低限制性內切酶的分類：I型：識別特定序列，切割位點在距識別位點至少1000 bp處隨機切割II型：識別特定序列并在識別位點處或附近切割III型：識別特定序列，切割位點在距識別位點3,端25? 27bp處隨機切割DNA連接酶的特點：DNA連接酶廣泛存在于各種生物體內，其催化的基本

6、反應是：將DNA雙鏈上的相鄰堿基的5' -P04和3' -OH共價結合形成3' -5'磷酸二酯鍵連接反應是一個吸能的反應，E.coli及其它細菌以 NAD為能源，動物及噬菌體以ATP為能源連接酶的最佳反應溫度是 37° C,但在這個溫度下，粘性末端之間的氫鍵結合是不穩(wěn)定的，因此連接反應的溫度一般在 4? 15°C基因工程中常用的 DNA連接酶是T4噬菌體DNA連接酶2、限制酶產生的末端的連接【1】相同粘性末端的連接 1、由同一種限制酶產生的帶相同突岀末端的兩個片段2、由不同的限制酶酶切但帶有相同突岀末端的兩個片段2平整末端的連接1、平整末端可

7、直接進行連接，但連接效率比粘性末端的連接要困難得多，所需的酶量也多S1核酸酶：特異性降解單鏈DNA和RNA,在最適條件下，降解單鏈的速度比雙鏈快75000倍。最佳pH 4.5核糖核酸酶 特異性降解 RNA用于除去DNA樣品中的RNA分子RNase H 降解DNA-RNA 雜交分子中的 RNA 鏈用于cDNA文庫建立時除去 RNA鏈以便第二條鏈 cDNA鏈的合成脫氧核糖核酸酶I （ DNase I）降解ss劑ds-DNA用途：制備 RNA樣品時除去 DNA分子切口移位，制備 DNA探針01、5' 3' DNA聚合酶活性，要求 3' -OH的引物和模板 DNA 2、5

8、9; 3'核酸外切酶活性，具有 雙鏈特異性3、3' -5'核酸外切酶活性，具有單鏈特異性，對ds-DNA的降解活性很低，是ss-DNA的過剩反應用途：除去3'-端突起的單鏈 DNA （在無dNTP時）；補齊5'-突起端合成第二條 cDNA ;切口 移位制備探針Klenow片段用途：用同位素標記具5,端突起的DNA片段末端；補平 5,粘性末端第二條cDNA鏈的合成；DNA序列測定標記基因的作用1 ）指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞2 ）指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。.標記基因的種類1）抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子

9、）a. 抗生素抗性基因： Apr , Ter , Cmr, Kanr, G418r, Hygr , Neorb, 重金屬抗性基因：Cur , Znr , Cdr ； c.代謝抗性基因：TK,抗除草劑基因2）營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉化子）：主要是參與氨基酸，核昔酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1, URA3, LEU2, HIS43） 生化標記基因其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ,GUS,CAT4）噬菌斑常用的遺傳標記基因：1）四環(huán)素抗性基因（Ter）； 2）氨節(jié)青霉素抗性基因（ Apr）3）氯霉素抗性基因（Cmr） ；4）卡那霉素

10、（Kanr）,新霉素（Neor ）和G418抗性（G418r ）基因5） p半乳糖昔酶基因（lacZ和lacZa或lacZ，）； 6）葡萄糖昔酸酶基因（ GUS）7）熒光素酶基因；8）發(fā)光蛋白質基因穿梭載體范圍：細菌一細菌（放線菌），細菌一酵母菌，細菌一真菌，細菌一動物表達型載體（expression vector）1）特點：a.基因的啟動了序列和終止了序列；b. 一般無檢測標記基因；c.克隆位點是確定的（即位于啟動子序列后）；d.重組分子用凝膠電泳檢岀（依賴于分子量差異）。2） 結構：a.轉化單元-宿主細胞轉化；b.表達單元-外源基因表達3） 類型： I 型：轉錄起始區(qū)（調控序列+啟動了）

11、+終止了II 型：轉錄起始區(qū) +翻譯起始區(qū)（核糖體結合序列和起始密碼子）+終止子III 型：轉錄起始區(qū) +翻譯起始區(qū) +信號肽鏈編碼區(qū) +終止子（常稱之為表達分泌型載體）4） 用途：a.表達外源基因以產生大量外源基因產物；b.用于構建cDNA文庫5） 注意事項：a.啟動子來源；b.終止子來源；c.啟動子的啟動效率；d.信號肽來源與結構；e.調控類型3. 失控型質粒載體 4.探針型載體 5 、定序型載體：主要用于核昔酸的序列測定6,整合型載體：結構與復制起點探針型載體相同，僅是用于不同目的，該類載體轉化頻率低，但轉化體十分穩(wěn)定。E.coli 克隆載體的種類1. 質粒載體一復制起點來自一些天然質粒

12、。2.噬菌體載體一入，P1和M13、fd載體，復制起 點來自噬菌體。 3. COS 質粒載體一質粒載體中插入 'cos 片段，以利于體外包裝4. 噬粒載體（phagemid ） 一有質粒和 M13、fd的復制起點，以質粒或噬菌體方式復制噬菌體X載體入噬菌體侵入菌體后，把自身 DNA 加進細菌 DNA 里（整合），作為細菌基因的一部分，隨 菌 的細胞分裂而增殖，這種生活狀態(tài)稱為溶原（ lysogen ）。入噬菌體從溶原轉為裂解是一 種可誘 導過程。 2、入噬菌體可以容納較大的目的基因：基因文庫構建常使用入載體；入噬菌體的缺陷：基因組太大（49kb）（ 2）酶切點太多野生型只能接納一定長度

13、的DNA入噬菌體的改造：切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因去掉太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口增加標記基因（4）引入無義突變核酸包括 DNA 、 RNA 兩種分了，在細胞中都是以與蛋白質結合的方式存在的真核生物 95%DNA 存在于細胞核內， 5%在細胞器75%的 RNA 存在于細胞質， 10%在核內， 15%在細胞器rRNA （80-85%） , tRNA 及核內小分了 RNA （ 10? 15%） , mRNA （1-5%）核酸分離提取的原則 1.保證核酸一級結構的完整性 2 .排除其它分子的污染質粒載體的分離與純化關鍵：如何使質粒 DNA 與宿主染色體 DNA 分開堿變性法提

14、取質粒DNA的步驟：收集細胞沉淀一加入溶液I （50mM葡萄糖，25mMTris-HCI,10mM EDTA, 45mg/mL 溶菌酶）一加入溶液 II （0.2M NaOH, 1%SDS （在強堿性環(huán)境中暴 露 時間過長， cccDNA 可發(fā)生不可逆變性）一加入溶液 III （3M NaAc pH4.8 離心除去沉淀， 得 含質粒 DNA 的上清液一苯酚抽提去除蛋白質一乙醇沉淀收集質粒DNA染色體DNA的分離純化關鍵：盡可能地保持其高分子量RNA的分離與純化關鍵：防止內外源RNase的作用RNase 的特點：抗酸抗堿 , 具很廣 pH 作用范圍；抗高溫嚴寒（ 0? 65°C 均具活

15、性， 100°C 也不能使之完全失活）；抗變性劑（變性劑只能使之暫時失活，去除變性劑后又可恢復活性）；酶活 性不需要輔助因子；存在范圍廣核酸貯存 ： DNA： 溶于 TE 中，放置于 4°C、 -20°C、 -70°CRNA： 溶于 0.3M NaAc （pH5.2）或ddH2O中，-70 °長期保存可以沉淀形式貯存于乙醇中，-20 °C凝膠電泳：脈沖場凝膠電泳、瓊脂凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子雜交技術：Southern 雜交( DNA ) , Northern Blotting ( RNA ) , Western Blottin

16、g (蛋白質)PCR技 術一個標準的 PCR 反應體系( 50-100 P1)50 mmol/L KC1 ； lOmmol/L Tris-HCl ( pH=8.4)；1.5mmol/L MgC12 ；100 u g/ml 明膠或牛血清白蛋白( BSA )； 2 個引物，各 0.25 u mol/L ；dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP ）各 200u mol/L ；模板 DNA （人基因組 DNA ） 0.1-1 u g ； TaqDNA 聚合酶 2U ； Denaturation 94 °C, 0.5min ； Primer annealing 55 °C,

17、 1.5mion ；Extension 72 C, °Imin ； 30 cycles 變性（模板）一退火（引物與模板）一延伸（新合成 DNA 鏈） 建立基因組文庫的一般程序1. 載體 DNA 片段的制備： DNA 分離純化一限制酶切一脫磷酸化反應2. 供體 DNA 片段的制備：總 DNA 分離純化一機械剪切法一分離特定大小 DNA 片段DNA 濃度和兩種DNA 分了導入 宿3. 供體與載體 DNA 連接：要提高重組頻率，應注意連接反應體系中的總DNA 分子的克分子比率4. 重組 DNA 分了的轉移和基因組文庫的擴增：利用轉化或感染方法將連接 主細胞，讓其自主復制，重組 DNA 分了

18、被擴增（重組了比率可能發(fā)生變化）5. 基因組文庫質量的評價1）文庫規(guī)模 - 隨機挑取一些轉化了或重組了，提取質粒DNA, 電泳測定插入片段大 小，然后根據上述公式計算文庫大小。2 ） 重組頻率 - 頻率越高，質量越高，可大大減輕后續(xù)篩選基因工作量。 利用質粒載體構建基因組文庫該法簡單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。CDNA文庫的特點：1.基因特異性；2.器官特異性；3.代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結構基因表達亦不相同； 4. 不均勻性； 5.各 cDNA 均可獲得表達（一般 選用的載 體都是表達型的）建立cDNA文庫的一般程序：1.載體DNA片段的制備

19、；2.多聚（A） RNA的分離與純化；3. 雙鏈 CDNA 的合成： 1）單鏈 CDNA 的合成：反轉錄法；2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（ RNaseH）法除去 RNA分子cDNA 第一鏈的合成cDNA 第二鏈的合成 自身引導法：獲得的雙鏈 cDNA 5' 端會有幾對堿基缺失 置換合成法：獲得的雙鏈 cDNA 5' 端也會有幾對堿基缺失 引導合成 法：獲得的雙鏈 cDNA 能保留完整的 5'端序列4. ds- cDNA 與載體 DNA 相連1 ） 人工接頭：要求具平端 ds- cDNA, 酶切時可能導致某些 cDNA 鏈斷裂2） 同聚物加尾：可大大減少載體 DN

20、A 自身連接； 3） cDNA 的定向插入5. 重組 cDNA 分了的轉移和文庫的建立選用載體為質粒，可直接轉化 E.coli ；若為入載體，則需進行體外包裝、感染等。 獲得基因的一般方法1. 化學合成方法：主要用于較小基因的合成，或需改變密碼子的基因。2. 半化學合成法： mRNA 一 cDNA - 加人工接頭或合成一段 DNA 與載體相連3. 篩選法：用于各種方法從基因組文庫或 cDNA 文庫中選擇目的基因甲基化酶活性對限制酶活性的影響11 .dem 和 dam 甲基化酶對限制酶的影響（1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識別順序是完全重疊還是邊界重疊（2）不能抑制某些限制酶活性，不

21、管兩者的識別順序為何種重疊2 II型甲基化酶對限制酶活性的影響（1）抑制同種限制酶的活性（2）抑制不同種限制酶的活性（3）抑制不同種限制酶的部分活性甲基化酶的用途（1 ）改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成（2 ）在建立基因文庫時，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子克隆載體的功能：為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力；為外源基因提供在受體細胞的復制能力或整合能力；為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力載體特點：1至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。2. 至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。3. 至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組D

22、NA分了是否進入宿主細胞分子克隆載體的轉化頻率和穩(wěn)定性.影響轉化頻率的因素：1）復制起點類型：盡可能選擇高拷貝復制起點2）標記基因：盡可能選擇局效表達的標記基因影響穩(wěn)定性的因素：1）復制起點類型一低拷貝載體穩(wěn)定，高拷貝載體穩(wěn)定性差2）選擇壓力3）載體在宿主細胞中的狀態(tài)一自主復制型和整合型；4）宿主細胞的遺傳特性和生理特性質粒的特點：1）質粒DNA復制與染色體復制無關 2）質粒DNA以超螺旋形式存在 3）質粒DNA 可以接合轉移 4）質粒的不相容性和不相容群5）質粒 DNA的消除一化學和物理法仆丫嚏染料，EtBr,高溫等）6）質粒的整合一 F因子又可整合到 E.coli染色體中質粒DNA的類型：

23、接合型和非接合型；含大腸桿菌素Col質粒和含抗菌；素抗性基因的R質粒；F因子和F'因子等。cos質粒載體優(yōu)點i.容量大（可達45 kb），用于基因簇的克隆ii.形成的重組DNA分了可進行體外包裝，并能感染E.coli細胞iii.操作簡便，可直接轉化細胞 iv.對重組DNA分子長度具有選擇性包裝 遺傳標 記：與質粒載體相同，利用抗生素抗性選擇轉化了革蘭氏陽性菌 （G+）克隆載體1. 枯草桿菌克隆載體1） B.subtilis作為宿主菌的優(yōu)點i.芽抱形成過程可用于闡明細胞發(fā)育過程ii.遺傳背景較清楚，可直接導入外源 DNA iii,非致病細菌，因而安全iv.研究結果可用于其它芽泡桿菌v.存

24、在各種分泌蛋白質2）B.subtilis作為宿主菌的缺點i .存在多種蛋白酶基因和相應產物ii.外源DNA導入細胞后不穩(wěn)定，易發(fā)生重組反應核酸提取的基本要求：盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；減少化學因素對核酸的降解（過酸、過堿）；減少物理因素對核酸的降解（機械剪切力、高溫）；防止核酸的生物降解提取核酸的?般程 序:破碎細胞去除與核酸結合的蛋白質及多糖等一去除其它核酸分子一淀核酸，去除鹽燈有機溶劑等雜質純化核酸核酸的質量評估（電泳、D260/OD280,酶切）DNA序列分析1.雙脫氧核昔酸鏈終止法Sanger法雙脫氧（2 3，）-核昔酸可以象 2-脫氧核昔酸那樣直

25、接摻入新合成的DNA鏈中，但因3'端不具0H基，DNA鏈合成至此中斷。山于雙脫氧核吾酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據不同長度的 DNA片段測定岀核昔酸序列2. Maxam-Gilbert 化學法原理： DNA 鏈上的不同堿基可以和堿基修飾劑發(fā)生反應，然后發(fā)生 1? 2 個堿基的脫落 或 取代，最后發(fā)生鏈斷裂，不同位置斷裂的 DNA 分子經凝膠電泳就可確定其核昔酸序列 化學法 測序的一大優(yōu)點是不需要模板，弓I物和DNA聚合酶。待測 DNA鏈的檢測用32P末端標記引物設計的一般原則 : ：引物的長度常為 17? 30； GC 含量為 40%? 60%； Tm 值高于 55 &#

26、176;C； 兩條引物間配對堿基數小于 5 個；引物自身配對（特別是在引物的3'端）形成的莖環(huán)結構，莖的堿基配對數不大于 3 （通常采用計算機輔助設計）建立cDNA文庫的一般程序：1.載體DNA片段的制備；2.多聚（A） RNA的分離與純化3. 雙鏈 cDNA 的合成： 1）單鏈 cDNA 的合成：反轉錄法2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（ RNaseH）法除去 RNA分子cDNA 第一鏈的合成； cDNA 第二鏈的合成自身引導法：獲得的雙鏈 cDNA5 ;端會有幾對堿基缺失；置換合成法：獲得的雙鏈 CDNA5' 端也會有幾對堿基缺失；引導合成法：獲得的雙鏈 cDNA 能保

27、留完整的 5'端序列4. ds- cDNA 與載體 DNA 相連： 1）人工接頭：要求具平端 ds-cDNA, 酶切時可能導致某些cDNA 鏈斷裂 2）同聚物加尾：可大大減少載體DNA 自身連接 3） cDNA 的定向插入5. 重組 cDNA 分了的轉移和文庫的建立選用載體為質粒，可直接轉化 E.coli ；若為入載體，則需進行體外包裝、感染等。 基因的篩選方法1. 遺傳互補法 優(yōu)點：簡便，快速，可靠，是首選方法。獲得的基因一定是完整基因。缺點：適用范圍較窄。 必備條件：外源基因不僅能在受體細胞表達，而且必須具備生物學活性。分離步驟分離基因組文庫重組 DNA 分子一轉化適當宿主細胞一涂

28、布在選擇培養(yǎng)基上一隨機挑選陽性克隆，分離重組 DNA 分子一再轉化相同受體細胞一高頻轉化子一基因的進一步證實和鑒定2. 核酸雜交法原理：利用核酸探針與待分離 DNA 的同源序列可進行雜交的特點分離目的基因（同源序列不是完全相同序列）優(yōu)點：不需要基因表達必備條件：合適的核酸探針或有關資料，外源 DNA 能在宿主細胞中擴增 分離步驟：基因（基因組或 cDNA ）文庫一制備 DNA 樣品膜一與標記探針雜交一雜交斑點（陽性克?。┮环蛛x重組 DNA 分子一作斑點雜交 陽性克隆 Southern 雜交以確認雜交 結果一 DNA 進一步證實和鑒定：核酸序列分析，與蛋白質一級結構比較；分離插入片段進行基因表達，用免疫方法或其他方法檢測表達產物3. 免疫法原理：外源 DNA 引人宿主細胞后表達出蛋白質，以此為抗原與相應的抗體發(fā)生免疫反應, 然后利用二抗與一抗反應，用二抗偶聯的酶反應篩選目的DNA優(yōu)點：不依賴于基因表達產物的生物學活性 , 只要抗原決定序列能被正確表達。分離步驟：基因文庫一蛋白質樣品膜制備一免疫法篩選一有色斑點（陽性克?。┮贿M