實(shí)驗(yàn)2柱色譜分離植物色素

1、實(shí)驗(yàn)2 柱色譜分離植物色素（一） 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1通過(guò)綠色植物色素的提取和分離，了解天然物質(zhì)分離提純方法； 2了解柱層析的基本原理，掌握柱層析的操作技術(shù)。3通過(guò)柱色譜分離操作，加深了解微量有機(jī)物色譜分離鑒定的原理。（二）實(shí)驗(yàn)原理層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個(gè)類型，分為吸附柱層析法和分配柱層析法。本實(shí)驗(yàn)僅介紹吸附柱層析法。吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機(jī)物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（極性）來(lái)選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對(duì)各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經(jīng)過(guò)活化

2、的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑 有氧化鋁、硅膠等）。當(dāng)混合物溶液流過(guò)吸附柱時(shí)，各組分同時(shí)被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對(duì)它們所吸附的強(qiáng)弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶，如圖所示。 9-1 色層的展開(kāi)在洗脫過(guò)程中，柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn)象。被吸附的組分被溶解吸出來(lái)，隨著溶劑向下移動(dòng)，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來(lái)，而繼續(xù)流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動(dòng)，這樣經(jīng)過(guò)適當(dāng)時(shí)間移動(dòng)后，各種組分就可以完全分開(kāi)，繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力最弱的組分隨溶劑首先流出，

3、再繼續(xù)加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。綠色植物如菠菜葉中含有葉綠素（綠）、胡蘿卜素（橙）和葉黃素（黃）等多種天然色素。葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素 a和葉綠素 b，其差別僅是 a 中一個(gè)甲基被 b 中的甲酰基所取代。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡(luò)合物，是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素 a 的含量通常是b的3倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團(tuán)，但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。 胡蘿卜素是具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即 a-,-和-胡蘿卜素，其中-異構(gòu)體含量最多，也最重要。在生物體內(nèi)，-體受酶催化氧化即形成維生素A

4、。目前-胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素 A 使用，也可作為食品工業(yè)中的色素。 葉黃素是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。本實(shí)驗(yàn)是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。(三） 主要試劑與儀器 研缽、布氏漏斗、圓底燒瓶、直形冷凝管、層析柱，抽濾瓶，燒杯，鐵架臺(tái)，脫脂棉，海沙，中性氧化鋁，乙醇，石油醚（6090），丙酮，菠菜葉（四） 操作步驟 1. 菠菜色素的提取 稱取5g 洗凈后的新鮮的菠菜葉，用剪刀剪碎后放入研缽，稍加研磨后加入約15mL 3:2（體積比）的石油醚/乙醇混合

5、液，繼續(xù)研磨約5min，然后用布氏漏斗抽濾菠菜汁，棄去濾渣。（可以用相同的方法再提取一次，合并濾液）將濾液轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入30mL水萃取洗滌（分兩次，每次15mL），以徹底除去萃取液中的乙醇。洗滌時(shí)要輕輕旋蕩，防止產(chǎn)生乳化。處于上層的石油醚層用無(wú)水硫酸鈉干燥后濾入圓底燒瓶，在水浴上蒸去大部分石油醚至體積約為2mL為止。2裝柱 取一支潔凈干燥的層析柱玻管，自柱口塞入少許脫脂棉并用長(zhǎng)玻棒推至柱底壓平（塞時(shí)不宜太緊）。從柱口小心裝入活性氧化鋁（160200目，于300- 400 活化34小時(shí)），邊裝邊輕輕敲打?qū)游鲋固钛b緊密均勻，直至氧化鋁粉柱高達(dá)8厘米時(shí)為止。然后在柱頂再加上一層0.5cm高的

6、海沙。將此層析柱固定在鐵架臺(tái)上，下面接一個(gè)干凈的抽濾瓶，裝置如圖所示。3加樣 打開(kāi)層析柱下端活塞，將抽濾瓶與水泵相連，抽氣減壓。用小燒杯從柱口沿管壁小心加入石油醚流出（切勿把氧化鋁表面沖亂）。當(dāng)柱頂尚留有12ml石油醚時(shí)，停止減壓（使用前抽濾瓶應(yīng)該干燥，這樣回收的石油醚倒出后，可以用于配制洗脫液），加入混合溶液2ml（預(yù)先準(zhǔn)備好的濃縮液）。待色素全部進(jìn)入柱體后，在柱頂小心加洗脫劑石油醚/丙酮溶液 9:1 （體積比）。打開(kāi)活塞，讓洗脫劑逐滴放出，層析即開(kāi)始進(jìn)行，用錐形瓶收集。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)有色成分即將滴出時(shí)，取另一錐形瓶收集，得橙黃色溶液，它就是胡蘿卜素。 用石油醚-丙酮 7:3 （體積比）作洗脫劑，

7、分出第二個(gè)黃色帶，它是葉黃素。再用丁醇/乙醇/水 3:1:1 （體積比）（或者用石油醚丙酮（1:1）溶液）洗脫葉綠素 a （藍(lán)綠色）和葉綠素 b （黃綠色）。收集各色帶后，轉(zhuǎn)入棕色瓶低溫保存。五注意事項(xiàng)1層析柱裝填緊密與否, 對(duì)分離效果影響很大。若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層）時(shí)，會(huì)影響滲透速度和顯色的均勻。2在吸附柱上端加入海沙是為了加樣品和洗脫劑時(shí)不致把吸附劑沖起，影響分離效果；在吸附柱下端加入脫脂棉是為了防止吸附劑細(xì)粒流出。3為了保持吸附柱的均一性，應(yīng)該使整個(gè)吸附劑浸泡在溶劑或溶液中，即從第一次注入乙醇起直至實(shí)驗(yàn)完畢，絕不能讓柱內(nèi)液體之液面降至沙層之下。否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時(shí)，會(huì)使柱身干裂。若再重新加入溶劑，會(huì)使吸附柱的各部