小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗抗體水平影響.docx

1、小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗抗體水平影響袁野"，李浩鵬2,邢小勇'胡永浩”(l.tf肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘簫蘭州730070：2.中牧股份(乾元浩生物股份仃限公司)，河南鄭州450000)摘要：本試臉旨在研完小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗抗體水平的影響，采用將免疫增強劑小分子發(fā)碑抗菌肽分別添加于正?？乖考敖淞靠乖康男鲁且逳D-禽流感(H9F株)二聯(lián)滅活苗，禽流感(H5N1亞型Re-6株.Re-7株)二價滅活苗中，分別免疫SPF雞。同時用不加免疫增強劑的新城疫-禽流感二聯(lián)滅活疫苗和禽流感二價滅活疫苗免疫SPF雞作為對照組。結(jié)果表明，通過監(jiān)測雞免疫后不同天數(shù)的血清抗體

2、水平，發(fā)現(xiàn)抗原用量不變的情況下，試驗組比對照組抗體效價均有提高；在抗原用量減少50%的卅況下試驗組比對照組抗體效價也均有一定的提高。結(jié)果提示，小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗能起到一定的抗體增強的效果。關(guān)鍵詞：免疫增強劑；小分子發(fā)酵抗菌肽;新城疫；禽流感；抗體滴度中圖分類號：S859.797文獻標識碼：B文章編號：1672-9692(2016)01-00()8-07EffectofvaccineantibodylevelsbasedonFermentationantimicrobialpeptideofsmallmoleculeoninactivatedvaccineagainstavianYu

3、anYe1,2,LiHaopeng2,XingXiaoyong1,HuYonghao1*(1.CollegeofVeterinaryMedicineofGansuAgriculturalUniversity,GansuLanzhou730070；2.ChinaAnimalHusbandryIndustryCO.,LTD.ZhengzhoubiologicalpharmaceuticalfactoryofQYHBiotechCompanyLimited),HenanZhenzhou450000)Abstract:Theexperimentwasconductedtostudytheimpacto

4、fantibodylevelsonantimicrobialpeptideofsmallmoleculefermentationoninactivatedvaccineaboutavian.Wehadusedthesmal1moleculeimmuneenhancerwereaddedtothenormalfermentationantibacterialpeptideantigencontentandthereductionoftheantigencontentofNewcastlediseaseNDandavianInfluenza(H9Fstrain)duplexinactivatedv

5、accineandavianinfluenzaH5N1Re-6strainandRe-7strainbivalentinactivatedvaccineinSPFchickenswereimmunized.AdditionNewcastlediseaseandavianinfluenzaduplexinactivatedvaccineandavianinfluenzaH5N1Re-6strainandRe-7strainbivalentinactivatedvaccinewithoutimmuneenhancerimmunizedSPFchickensasacontrolgroup.There

6、sultsshowedthatmonitoringtheserumantibodylevelsofchickenbydifferentdaysafterimmunization,theamountofantigenwasfoundunderthesamecircumstances,theexperimentalgroupwereincreasedthanthecontrolgroupinantibodytiters,andreducingtheamountofantigeninhalfofcasesintheexperimentalgroupwereincreasedthanthecontro

7、lgroupinantibodytiters.Thestudysuggestthatantimicrobialpeptideofsmal1moleculefermentationinactivatedvaccineagainstavianantibodieswouldimprovethespecificenhancedeffect.Keywords:Immunostimulants;Antimicrobialpeptideofsmallmoleculefermentation;Newcastle：Avianinfluenza;Titerofantibody收稿日期：2015-11-02作者簡介

8、:袁野(1983-),男，河南鄭州人，博L研究生，主要從事生物制品、藥品的研發(fā)與生產(chǎn).通訊作者：胡永浩(1962-),男，甘肅古浪人，教授，碩士生導(dǎo)師.研究方向為動物傳染病學(xué)。基金項目：國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)生物西藥新產(chǎn)品研究和創(chuàng)制(2011AA10A214).新城疫(Newcastledisease,ND)和禽流感(avianinfluenza)是危霄禽類的重大疾病，其病原分別是新城疫病毒和禽流感病毒，都屬于高度接觸性傳染病，對世界養(yǎng)禽業(yè)危害7。目前，新城疫和禽流感的預(yù)防主要是接種疫苗"，雞新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、基因工程苗而弱毒疫苗為目前市

9、場上最常見的疫苗。禽流感現(xiàn)階段常見的疫苗為全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組活載體疫苗心|。雖然使用常規(guī)疫苗免疫接種可以防治新城疫、禽流感，但在實際情況下常規(guī)單苗存在免疫繁瑣，免疫效果不盡理想，成本高等缺點，針對市場的需求，進而研制出既節(jié)約成本乂增強免疫效果的免疫增強劑。小分子發(fā)酵抗菌肽屬于有機肽類，具有廣譜抗菌抗病毒活性網(wǎng)，無殘留，無副作用，無酎藥性，熱穩(wěn)定好，耐熱100C,10min,使用方便，分子質(zhì)量小，水溶性好，強堿性，還具有抗原蟲殺痛作用仆。使用過小分子發(fā)酵抗菌肽的商盒(如禽飼喂適破)抗病能力增強，生產(chǎn)性能優(yōu)良，經(jīng)濟效益度好。禽用疫苗的生產(chǎn)成本逐年增高，疫苗客尸群對疫苗免疫效

10、果的要求愈高，為能降低滅活苗成本，同時又能增強抗體的實用效果。本研究在正?？乖考皽p量抗原含量下，通過不添加免疫增強劑作為對照組，探討小分子發(fā)酵抗菌肽對雞體感染新城疫，禽流感的免疫調(diào)節(jié)作用，為應(yīng)對新城疫，禽流感能夠達到更加理想的免疫預(yù)防效果奠定了理論依據(jù)"叫1材料與方法1.1試驗動物28日齡SPF雞125只均購自乾元浩生物股份有限公司。1.2主要試劑小分子發(fā)酵抗菌肽：購自中農(nóng)穎泰生物股份有限公司99%(純品)°二硬脂酸鋁：購自溫州(20140102)o司本-80：購白廣東省肇慶市超能實業(yè)有限公司(20131208)。吐溫-80：購自廣東省肇慶市超能實業(yè)有限公司(20130

11、419)1.3主要儀器M52：購自法國(VG5111304P)。T-18型臺式微型剪切機購自德國IKA公司。LS900激光顆粒粒度分析儀購自青島歐美克公司。八道移液器：購自德國艾本德公司。IKAT10微量乳化機、離心機：購自德國IKA公司。1.4疫苗疫苗由乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠提供。1.5小分子發(fā)酵抗菌肽的制備1.5.1小分子發(fā)酵抗菌肽水相的制備將5mg小分子發(fā)醵溶于5mL生理鹽水(0.85%)中，使其濃度為1mg/mL(1yg/uL)：取含滅活抗原的水相2mL,加入上述小分子發(fā)酵溶液80UL,混勻待用，即為小分子發(fā)酵免疫增強劑疫苗的水相，最終疫苗中小分子發(fā)酵濃度達到10Pg/mL

12、o水相最終pH應(yīng)為6.07.0o1.5.2小分子發(fā)酵抗菌肽油相的制備由中國牧工商集團總公司(乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠)提供疫苗油相，小分子發(fā)酵免疫增強劑疫苗需要6mL油相。1.5.3小分子發(fā)酵抗茵肽的乳化按中國牧工商集團總公司(乾元浩生物股份有限公司鄭州生物藥廠)8mL體積滅活疫苗配方，進行乳化配苗：將配制好的油相先與小分子發(fā)酵抗菌肽的水相用德國IKAT18型高速剪切機先進行預(yù)乳化，待將水相加入完全后，按一定轉(zhuǎn)速、時間乳化結(jié)束，分裝以備用于動物試驗。1.6疫苗物理性狀的檢測取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，應(yīng)呈油滴狀不擴散為宜。取10mL疫苗于離心管中，經(jīng)3500r/min離心1

13、5min,應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象；疫苗在37C左右條件，放置21d不應(yīng)有破乳現(xiàn)象為佳。用下口內(nèi)徑為1.2mm,上口內(nèi)徑為2.7mm的1mL移液吸管在25C左右的條件下吸取疫苗1mL,令其垂直流出，記錄流出0.4mL所需的時間。取5PL疫苗混勻于10mL白油中，置于LS900激光粒度分析儀中檢測。1.7疫苗無菌檢測疫苗抽樣，分別取硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基2支，瓊脂培養(yǎng)基2支，葡萄糖培養(yǎng)基1支，每支接種疫苗0.2mL分別放置于37C,25C培養(yǎng)箱中做無菌檢驗。1.8免疫接種試驗取3周齡的SPF雞125只，分13組：第12組每組禽流感(Re-6+Re-7)免疫劑量0.3mL/羽，第1組添加小分子發(fā)酵抗菌肽：第34

14、組每組禽流感H9F株免疫劑量0.2mL/羽，第3組添加小分子發(fā)酵抗萌肽：第56組每組新城疫ND免疫劑量20UL/羽；第5組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第712各組每羽份在原有抗原含量基礎(chǔ)上抗原含量全部減半：第78組每組禽流感(Re-6+Re-7)免疫劑量0.3mL/羽，第7組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第910組每組禽流感H9F株免疫劑量0.2mL/羽，第9組添加小分子發(fā)酵抗菌肽；第1112組每組新城疫ND免疫劑量20uL/羽；第11組添加小分子發(fā)酵抗菌肽:第13組取5只作為空白對照，不進行免疫接種。1.9HI抗體檢測SPF雞分別在免疫后21、28、35d采血、測抗體。2結(jié)果與分析2.1疫苗物理性狀的檢測

15、添加小分子發(fā)酵抗菌的疫苗顏色無變化，呈乳白色，無破乳現(xiàn)象，且無分層現(xiàn)象，粘度、顆粒度也和普通疫苗無明顯差異。2.2疫苗的無菌檢測添加小分子發(fā)酵抗菌的各組疫苗均呈無藺狀態(tài)。2.3疫苗的免疫試驗2.3.1抗原含量正常時禽流感(Re-6株、Re-7株)疫苗的免疫增強試驗結(jié)果一對照組-實臆組58587Apoq=ue王W較毋蛤一H71121d28d35dSPF雞日齡/dTime圖1Re-6株試驗結(jié)果Fig,1ExperimentalresultsofRe-6diseasedplant21d28d35dsa-s>>poq=UEihW聚型垢XSPF雞日齡/dTime圖2Rg-7株試驗結(jié)果Fig.

16、2ExperimentalresultsofRe-7diseasedplant免疫后結(jié)果顯示，抗原含量正常時，由圖1和圖2可以看出，禽流感H5N1Re-6株和Re-7株，試驗組比對照組均有增強效果。并且，從28d到35d,試驗組、對照組抗體效價均呈上升趨勢：由圖1訶以看出，Re-6株試驗組比對照組抗體效價提高明顯，21d時，提高0.4個滴度，28d時提高1.0個滴度，35d時提高1.1個滴度；由圖2可以看出，Re-7株試驗組比對照組抗體效價均有提高，在21d時,提高0.7個滴度，28d時提高0.2個滴度，35d時提高0.2個滴度。2.3.2抗原含量正常時新城疫ND、禽流感H9F株疫苗的免疫增強

17、試驗結(jié)果6對照蛆Y-實教蛆5.5*.21d28dSPF雞日齡/dTime圖3ND試驗結(jié)果Fig.3ExperimentalresultsofND圖4H9F株試映結(jié)果Fig.4ExperimentalresultsofH9Fdiseasedplant理Apoq-iDX由圖3可以看出，ND試驗組比對照組抗體效價略有提高，28d時提高0.2個滴度，35d時提高0.4個滴度：由圖4可以看出，F(xiàn)株試驗組比對照組抗體效價提高明顯，其中，21d時，比對照組提高0.8個滴度，28d時，比對照組提高0.7個滴度，35d時，比對照組提高0.3個滴度。2.3.3抗原含量減半時念流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免

18、疫增強試驗結(jié)果29864289.&&&&ApoqleX金攝毋信X一一對照組-實驗組SPF雞日齡/dTime圖5Re-6株試驗結(jié)果Fig.5ExperimentalresultsofRe-6diseasedplant6.5-、61'21d28d35dSPF雞日齡/dTime圖6Re-7株試驗結(jié)果Fig.6ExperimentalresultsofRe-7diseasedplant9585787se-sApoq=u任h蠢蓄H-對照組實駛組由圖5和圖6可以看出，Re-6株和Re-7株，試驗組比對照組都有一定增強效果；由圖5可以看，Re-6株試驗組比對照組抗體效

19、價均有提高，21d時提高0.6個滴度，28d時提高0.3個滴度，35d時提高0.1個滴度；由圖6可以看出，Re-7株試驗組比對照組抗體效價均有提高，21d時提高0.5個滴度，28d時提高0.2個滴度，35d時提高0.6個滴度。2.3.4抗原含量減半時新城疫ND、禽流感H9F株疫苗的免疫增強試驗結(jié)果由圖7和圖8可以看出，ND、F株試驗組比對照組均有提高；由圖7可以看出，ND試驗組比對照組均有提高，21d時，提高0.5個滴度，28d時，提高0.5個滴度，35d時，提高0.4個滴度；由圖8可以看出，F(xiàn)株試驗組比對照組略有提高，28d時,提高0.2個滴度，35d時，提高0.4個滴度。3討論抗菌肽是一類

20、由原核動物與真核動物體內(nèi)均能合成的多肽，具有小分子、強陽離子性、熱穩(wěn)定性好、無藥物屏蔽且不影響真核細胞等特點。抗萌肽通常作用于細菌，在真核生物的天然免疫方面發(fā)揮著重要作用，被認為是古代進化中哺乳動物體內(nèi)有效保留的免疫分子"。劉莉如等由通過飼糧添加天蠶素抗菌肽可不同程度提高蛋用仔公雞生長性圖7ND試驗結(jié)果Fig.7ExperimentalresultsofNDSJO-SApoqnuwI卒與姓垢XSPF雞日齡/dTime圖8H9F株試驗結(jié)果Fig.8ExperimentalresultsofH9Fdiseasedplant能、免疫器官指數(shù)，并能有效降低前炎性細胞因子基因的mRNA相對表達

21、水平。抗菌肽一般通過飼料添加的方式以提高動物機體的免疫水平，但作為疫苗免疫增強劑研究不多見。本試驗通過在抗原量相同的情況下，隨著動物免疫天數(shù)的逐步增加，對于同種抗原而言，小分子發(fā)酵抗菌肽的添加組比同抗原不添加組抗體效價均有所提高，禽流感試驗組比對照組抗體效價均有提高，新城疫ND試驗組比對照組抗體效價略有提高，禽流感F株試驗組比對照組抗體效價提高明顯。試驗結(jié)果表明，在獸醫(yī)免疫中，小分子發(fā)酵抗菌肽可以作為疫苗添加劑以增強免疫效果。本試驗還通過在抗原用量減少50%的情況下，小分子發(fā)酵抗茜肽的添加，使得禽流感試驗組比對照組抗體效價有所提高，而新城疫ND試驗組比對照組均有提高，禽流感F株試驗組比對照組略

22、有提高;在抗原用量減少50%時，試驗期望達到正常抗原含量試驗中的抗體效價水平，而從不同抗原含量的試驗結(jié)果看，在抗原用量減少50%情況下，禽流感(Re-6+Re-7)、新城疫ND和禽流感F株抗體效價均比對照組高。本試驗對小分子發(fā)酵抗菌肽作為禽用疫苗免疫增強劑進行初步研究，試驗結(jié)果表明，小分子發(fā)酵抗菌肽對禽用滅活疫苗能起到抗體增強的效果。小分子發(fā)酵抗菌肽作為疫苗增強劑應(yīng)用前景廣泛，但作為疫苗增強劑的最佳添加劑量、添加時間以及免疫增強機制都有待進一步研究。參考文獻ALEXANDERDJ,ALDOUSEW,FULLERCM.Thelongview:aselectivereviewof40yearsof

23、NewcastlediseaseresearchJ.AvianPathol,2012,41(4):329-335.1 ALEXANDERDJ.NewcastlediseaseintheEuropeanUnion2000to2009J.AvianPathol,2011,40(6):547-558.2 王志全，丁嗣，梁媛媛.新城疫研究進展及綜合防治J.中國畜禽種業(yè),2014年第102卷第2期：136-137.3 王賀民，秦素琴，魏濤，等.雞新城疫疫苗研究進展J.中國家禽,2006,28(18)：48-51.4 雷彩霞，夏業(yè)才，李俊平.中國禽流感診斷技術(shù)和疫苗的研究進展J.中國獸藥雜志,2006(1

24、):32-39.5 武發(fā)菊，劉學(xué)榮，尚勇良，等.新城疫疫苗的研究進展J.中國畜牧獸醫(yī),2011,38(10)：145-148.6 SpradbrowPB.Newcastlediseaseinvillagechickenscontrolwiththermostableoralvac-cineJ.VirusRes,1994(32):373-379.7 HaroIdoToro,De-chuC,Tang,etal.Protectiveavianinfluenceinovovaccinationwithnon-replieatinghumanadenovirusvectorJ.Vaccine,2007,25:2886-2891.8 NeumannG,KawaokaY.ReversegeneticsofinfluenzavirusJ.Virology,2001,25:243-250.9 杜淑環(huán)，劉秀明，萬秋，等.天蠶素抗菌肽的研究進展J.動物營養(yǎng)學(xué)報,2012,24(1):41-47.10 陳琛，吳三橋，李新生，等.抗菌肽SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計策略J.生物工程學(xué)報，2011,27(6)：846-8