微生物鑒定中的生理生化試驗

1、微生物鑒定中的生理生化試驗一實驗?zāi)康?. 證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2. 掌握進行微生物大分子物質(zhì)水解試驗的原理和方法。3. 了解糖發(fā)酵的原理，掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。4. 了解吲哚和甲基紅試驗的原理以及其在腸道細菌鑒定中的意義和方法。二實驗原理由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的鑒定中，生理生化試驗占有重要的地位。具體的原理如下：1. 大分子水解試驗微生物對大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能

2、直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較小化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等，這些過程均可通過觀察細菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實。如淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，但細菌水解淀粉的區(qū)域，用碘液測定時，不再產(chǎn)生藍色，表明細菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH，使pH降低，加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會使培養(yǎng)基從淡紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色，說明細胞外存在脂肪酶。2. 糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細菌的鑒定上尤為

3、重要，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源，但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異，有些細菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、加完、二氧化碳等），有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨、指示劑（溴甲酚紫）、倒置的德漢氏小管和不同的糖類。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，溴甲酚紫指示劑可由紫色（pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2）。氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。3IMViC試驗IMViC是吲哚（indol）、甲基紅（methyl r

4、ed test）、伏-普（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽（citrate test）四個實驗的縮寫，主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，多用于水細菌學(xué)檢查。硫化氫試驗也是檢查腸道桿菌的生化試驗。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中超過一定數(shù)量，則表示受糞便污染，產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水時要將兩者分開。吲哚試驗是用于檢測吲哚的產(chǎn)生，某些細菌可產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。對二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（紅色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗可以作為一個生物化學(xué)檢測的指標。色氨酸水解反應(yīng)：吲哚與對二甲基

5、氨基苯甲醛反應(yīng)：大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當細菌代謝糖產(chǎn)生酸時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機酸，但這個試驗在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價值的。這兩個細菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6，因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。三實驗器材1. 菌種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌

6、、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。2. 培養(yǎng)基和試劑（1）培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵試驗）；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。（2）溶液和試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、中性紅試劑等。3. 儀器及其它用品酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿、試管、燒杯、量筒、德漢氏小管、無菌操作臺等。四操作步驟1. 培養(yǎng)基的配制及滅菌按附錄所示配方稱量各組分，配制培養(yǎng)基（注意：在配置油脂培養(yǎng)基時不能使用變質(zhì)油，油和瓊脂及水先加熱，調(diào)好PH后最后加入中性紅；在配置糖發(fā)酵培

7、養(yǎng)基時將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基（PH7.6）以及糖溶液分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管，使之充滿培養(yǎng)基）。配制分裝包扎完成后放入滅菌鍋中113滅菌20min。2. 倒平板，接種及培養(yǎng)（1）淀粉水解試驗 倒平板：無菌條件下將冷卻至50下的淀粉培養(yǎng)基倒平板并冷卻至室溫。 接種及培養(yǎng)：用記號筆在平板底部劃成四部分，并標記各分區(qū)所接種的名稱。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在所標定對應(yīng)的不同的區(qū)域點種（注：由于四種菌對淀粉的水解程度不同，為防止由于接種量過大導(dǎo)致四種菌對應(yīng)區(qū)域水解部位發(fā)生重疊，宜采用點種的方式，如下圖1）。接種完成貼好標簽后在37條件下培養(yǎng)兩天。

8、圖 2油脂水解試驗接種示意圖圖 1淀粉水解試驗接種示意圖（2）油脂水解試驗 倒平板：無菌條件下將冷卻至50下的油脂培養(yǎng)基倒平板并冷卻至室溫（注：倒平板時，需不斷攪拌，使油均勻分布于培養(yǎng)基中）； 接種及培養(yǎng)：用記號筆在平板底部劃成四部分，并標記各分區(qū)所接種的名稱。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在所標定對應(yīng)的不同的區(qū)域劃十字線接種（如上圖2所示）。接種完成貼好標簽后在37條件下培養(yǎng)兩天。（3）糖酵解試驗 葡萄糖酵解的接種及培養(yǎng)：用記號筆在各試管上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名（大腸桿菌，普通變形桿菌）。取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管5支，按編號2支接種大腸桿菌， 2

9、支接種普通變形桿菌，剩余的1支作為空白對照不接種。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。 乳糖酵解的接種及培養(yǎng)：用記號筆在各試管上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名（大腸桿菌，普通變形桿菌）。取盛有乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管5支，按編號2支接種大腸桿菌，2支接種普通變形桿菌，剩余的1支作為空白對照不接種。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。（4）IMViC試驗 吲哚實驗的接種及培養(yǎng)：用記號筆在各試管上標明所接種的菌名。取盛有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管4支，按編號2支接種大腸桿菌，另2支接種產(chǎn)氣腸桿菌。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。 甲基紅實驗的接種及培養(yǎng)：用記號筆在各試管上標明所接種的菌名。取盛有葡萄糖蛋白胨水

10、培養(yǎng)基的試管4支，按編號2支接種大腸桿菌，另2支接種產(chǎn)氣腸桿菌。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。3. 結(jié)果的檢驗（1）大分子水解試驗的檢驗 淀粉水解試驗的檢驗：觀察各種細菌的生長情況，打開平板的蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板，觀察水解圈，出現(xiàn)水解圈的為陽性，記錄試驗結(jié)果。 油脂水解試驗的檢驗：取出平板，觀察各種細菌產(chǎn)生的菌苔顏色，出現(xiàn)紅色菌苔的為陽性，記錄試驗結(jié)果。（2）糖發(fā)酵試驗的檢驗：取出各試管，與空白對照組對照觀察培養(yǎng)基的顏色以及倒立的小管中氣泡的有無，若培養(yǎng)基變成黃色則說明細菌分解糖類并產(chǎn)酸；若倒立的小管中有氣泡存在，則說明細菌分解糖類并產(chǎn)氣。產(chǎn)

11、酸產(chǎn)氣的為陽性。（3）IMViC試驗的檢驗 吲哚試驗的檢驗：取出各試管，向培養(yǎng)基中加入34滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性。 甲基紅試驗的檢驗：取出各試管，向培養(yǎng)基的培養(yǎng)物內(nèi)加甲基紅試劑2滴。培養(yǎng)基變黃為陰性，紅為陽性。五 實驗結(jié)果及分析1. 實驗結(jié)果（理論實驗結(jié)果）A大分子物質(zhì)的水解試驗（1） 淀粉水解試驗（我們的實驗也得到了預(yù)期的結(jié)果）表1 淀粉水解試驗結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌+可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉金黃色葡萄球菌-不可以水解淀粉銅綠假單胞菌-不可以水解

12、淀粉（2） 油脂水解試驗表2 油脂水解試驗(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌-不可以水解油脂枯草芽孢桿菌-不可以水解油脂金黃色葡萄球菌-不以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂B. 糖發(fā)酵試驗（1） 葡萄糖發(fā)酵試驗表3 葡萄糖發(fā)酵試驗（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色變化黃色黃色紫色是否產(chǎn)氣是是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解葡萄糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對照組（2） 乳糖發(fā)酵試驗表4 乳糖發(fā)酵試驗（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色變化紫色紫色紫色是否產(chǎn)氣否否否陰/陽性-結(jié)論大

13、腸桿菌不能分解乳糖，故不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌不能分解乳糖，故不產(chǎn)酸不氣。對照組C. IMViC試驗（1） 吲哚試驗表5 吲哚試驗（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌是否產(chǎn)生紅色環(huán)狀物是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解色氨酸為吲哚產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚（2） 甲基紅試驗表6 甲基紅試驗（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌顏色變化變紅變黃陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH產(chǎn)氣腸桿菌轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物2. 實驗結(jié)果分析理想上的試驗結(jié)果如上述表格所示，但是我們組的實驗只有淀粉水解試驗是成功的，其他的是失敗的。其中由淀粉水解試驗可以得出

14、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌能產(chǎn)生淀粉酶的結(jié)論，枯草芽孢桿菌菌落周圍的透明圈較大腸桿菌周圍的透明圈大，可以大體判斷前者較后者代謝利用淀粉的能力強。通過油脂水解試驗，理想上的結(jié)果是銅綠假單胞菌能產(chǎn)生脂肪酶分解脂肪從而出現(xiàn)紅色斑點狀菌苔，但可能是培養(yǎng)基的原因，我們的實驗失敗了。通過糖酵解實驗，理想結(jié)果應(yīng)為大腸桿菌和普通變形菌都能夠分解葡萄糖，但是普通變形菌不能夠分解乳糖。但實驗結(jié)果卻是普通變形菌不能分解乳糖，與事實相違背，實驗失敗。究其原因可能是菌種在接種時出現(xiàn)失誤而接種失敗或是菌種本身存在有問題，還有可能是接種量太少，培養(yǎng)時間不夠等原因。在吲哚試驗中，理想結(jié)果是大腸桿菌具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，而

15、產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚。在甲基紅實驗中，理論上是大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH，產(chǎn)氣腸桿菌轉(zhuǎn)化有機酸為非酸性末端產(chǎn)物，我們的實驗也失敗了，試驗失敗有可能是因為培養(yǎng)基配錯或菌種的原因。六 注意事項1. 淀粉水解試驗中，觀察各種細菌生長情況時，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板。2. 油脂水解試驗中，制備固體油脂培養(yǎng)基時，應(yīng)充分搖蕩，使油脂均勻分布。3. 接種前要用記號筆做好標記，接種時要對號接種。4. 糖發(fā)酵試驗中，接種后要輕緩搖動試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡。否則會造成假象，得出錯誤的結(jié)果。5. 吲哚試驗中，注意加入34滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1

16、min，待乙醚上升后，再沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。否則就會觀察不到在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生的紅色環(huán)狀物。6. 甲基紅試驗中，應(yīng)該注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現(xiàn)假陽性。七思考題1. 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：菌苔周圍產(chǎn)生水解圈，可知淀粉在細胞外被水解，應(yīng)該是細菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2. 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解為葡萄糖才能被細胞利用，因此可以換用斐林試劑。呈陽性者則說明產(chǎn)生了葡萄糖，淀粉被水解；陰性者說明淀粉未被水解。3. 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？答：由于產(chǎn)生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若，

17、因此顏色不變化，仍為紫色。德漢氏小管中有氣柱。4. 討論IMViC試驗在醫(yī)學(xué)檢驗上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產(chǎn)氣腸桿菌引起的。5. 解釋在細菌培養(yǎng)中吲哚檢測的化學(xué)原理，為什么在這個試驗中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：某些細菌可產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。對二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是紅色物質(zhì)，便于觀察。附錄 實驗中用到的各種培養(yǎng)基配方1 固體淀粉培養(yǎng)基蛋白胨 10gNaCl 5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g蒸餾水 1000mL瓊脂 1520g121滅菌20min。2 固體油脂培養(yǎng)基蛋白胨 10g牛肉膏 5gNaCl 5g香油或花生油 10g1.6%中性紅水溶液 1mL瓊脂 1520g蒸餾水 1000mLpH 7.2121滅菌20min。注：（1）不能使用變質(zhì)油。（2）油和瓊脂及水先加熱。（3）調(diào)好pH后再加入中性紅。（4）分裝時，需不斷攪拌，使油均勻分布于培養(yǎng)基中。3. 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)蛋白胨水培養(yǎng)基 1000mL NaCl 5g葡萄糖 12