端粒酶—腫瘤治療研究新方向——周冰峰、龍妮婭

1、貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)酶工程論文（2010級(jí)） 題 目 端粒酶腫瘤治療研究新方向 班 級(jí) 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)專業(yè)2010級(jí) 學(xué)生姓名 周冰峰 龍妮婭 完成日期 2013 年 11 月 18 日 端粒酶腫瘤治療研究新方向周冰峰 龍妮婭摘要：端粒（telomere）是存在于真核細(xì)胞染色體末端的一段富含GC串聯(lián)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)；端粒酶（telomerase）是一種由蛋白質(zhì)和RNA構(gòu)成的核糖核蛋白體，為RNA依賴的DNA聚合酶，也即逆轉(zhuǎn)錄酶，可以催化端粒DNA的合成。正常人體細(xì)胞的端粒酶活性檢測(cè)呈陰性，而在85%以上惡性腫瘤患者的腫瘤細(xì)胞中端粒酶是高度活躍的，呈現(xiàn)陽(yáng)性，也即在端粒酶作用下，腫瘤細(xì)胞染色體端

2、粒不會(huì)隨細(xì)胞分裂而縮短，因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)，我們可以運(yùn)用端粒酶作為治療腫瘤的靶點(diǎn)，為腫瘤治療提供一個(gè)新的研究方向。關(guān)鍵詞：端粒 端粒酶 細(xì)胞 腫瘤治療1、 端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn) （一）端粒早在20世紀(jì)30年代，諾貝爾獎(jiǎng)得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock 已經(jīng)觀測(cè)到染色體的末端結(jié)構(gòu)在避免染色體之間的融合起到重要的作用，從而猜測(cè)它可能有保護(hù)染色體的作用1,2，之后，在20世紀(jì)70年代初對(duì)DNA聚合酶特性的深入研究引申出染色體并沒(méi)有隨著復(fù)制后RNA引物的降解而縮短，其自然末端也沒(méi)有相互融合，這就暗示了有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)在保護(hù)染色體復(fù)制

3、過(guò)程中免遭融合、縮短，由此，人們把染色體末端這一特殊結(jié)構(gòu)定義為端粒（telomere）3。 （二）端粒酶真核生物DNA的復(fù)制只能沿著5一3方向進(jìn)行，并需要有互補(bǔ)單鏈作模板，還要求有一定長(zhǎng)度的RNA作為引物。隨著引物的切除，隨從鏈5末端總有一段相當(dāng)于RNA引物長(zhǎng)度的DNA不能完整復(fù)制下來(lái)，這必然導(dǎo)致染色體DNA隨著每一次的細(xì)胞分裂其端區(qū)不斷縮短，這就是Warson于1972年提出的“末端復(fù)制問(wèn)題(end replication problem)”4。但Larson和Spangler等在對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的四膜蟲(chóng)的研究中卻發(fā)現(xiàn)其端區(qū)不見(jiàn)縮短，甚至還有所延長(zhǎng)。針對(duì)這一矛盾，Blackburn和Greide

4、r等5認(rèn)為四膜蟲(chóng)端區(qū)的延長(zhǎng)不可能是DNA聚合酶作用的結(jié)果，而是另有原因。后來(lái)他們?cè)谒哪はx(chóng)的細(xì)胞提取液中發(fā)現(xiàn)了一種酶活性成分，能往端粒區(qū)添加重復(fù)序列TTGGGG，當(dāng)時(shí)稱之為末端轉(zhuǎn)移酶，這就是現(xiàn)在所稱的端粒酶(telomerase)。2、 端粒酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制 （一）端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶是一種特殊的核糖核蛋白酶復(fù)合體，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性能夠以自身的RNA為模板合成端粒DNA。端粒酶結(jié)構(gòu)主要包括3部分：端粒酶RNA( telomerase RNA，TR)；端粒酶催化亞單位(telomerase catalytic subunit，TERT)和端粒酶相關(guān)蛋白質(zhì)1(telomerase associate

5、dprotein 1，TPlTLPl)；另外，還有hSP90(heat shock protein 90)，p23和dyskerin等6。這其中最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)就是TR和TERT。人端粒酶RNA（hTR）主要負(fù)責(zé)指導(dǎo)端粒重復(fù)序列的合成，hTR的結(jié)構(gòu)改變或成分的丟失均會(huì)影響端粒酶的活性。其次，端粒酶催化亞單位（hTERT）是一個(gè)包含1132個(gè)氨基酸殘基的多態(tài)鏈，它具有逆轉(zhuǎn)錄酶的共同結(jié)構(gòu)，也即7個(gè)蛋白質(zhì)域以及端粒酶催化亞基獨(dú)特的T框架保守區(qū)域，其編碼基因位于染色體5p上；hTERT是端粒酶起作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和主要調(diào)控亞單位，它可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄hTR模板序列，合成端粒DNA重復(fù)序列并且添加到染色體末端，從而

6、延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度。（2） 端粒酶的作用機(jī)制 端粒酶的活性調(diào)控，包括 mRNA 剪接與成熟，hTERT 和 hTR 基因轉(zhuǎn)錄，不同組分之間的定位和移位，轉(zhuǎn)錄后修飾，具有活性的端粒酶組合，端粒酶結(jié)合到端粒產(chǎn)生延長(zhǎng)作用等多個(gè)水平進(jìn)行。伴隨端粒酶活性的增加，hTERT-mRNA表達(dá)水平也相對(duì)應(yīng)成一定比例增加，并且在癌細(xì)胞和正常組織中的表達(dá)有很大的不同，據(jù)此可認(rèn)定，調(diào)控人類端粒酶活性的主要亞單位是 hTERT，只要 hTERT 表達(dá)，其他亞單位就會(huì)與其共同構(gòu)成高活性的端粒酶全酶7。因此，端粒酶的核心作用是延長(zhǎng)端粒，從而維持端粒在復(fù)制分裂中保持一定長(zhǎng)度，為細(xì)胞具有不斷復(fù)制提供遺傳基礎(chǔ)。 TR和TERT是端粒酶

7、發(fā)揮作用的核心組分，分別提供模板和逆轉(zhuǎn)錄酶合成端粒DNA。癌細(xì)胞中端粒酶的激活及活性的維持可能是多種因素在多個(gè)水平對(duì)不同分子靶作用的結(jié)果。正常組織廣泛表達(dá)hTR和hTP1，而hTERT的表達(dá)被抑制，大多數(shù)端粒酶陽(yáng)性的腫瘤和永生化細(xì)胞系中均表達(dá)hTERT；此外，在端粒酶陰性細(xì) 胞中導(dǎo)入hTERT即可檢測(cè)到端粒酶活性，這就說(shuō)明hTERT的表達(dá)與端粒酶活性是平行的，hTERT的激活對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的激活是“必須的和足夠的”8。所以在端粒酶的激活過(guò)程中hTERT基因在細(xì)胞中的表達(dá)是決定端粒酶活性的關(guān)鍵9。3、 端粒酶活性的檢測(cè)技術(shù)端粒酶的常用檢測(cè)方法有三種：（1） 端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telom

8、ere repeat amplification protocol，TRAP)它是端粒酶活性檢測(cè)的基本方法10，在此基礎(chǔ)上又衍生出許多更加簡(jiǎn)便靈活的檢測(cè)方法，比如TRAP-PAGE、TRAPELISA等；但是對(duì)于端粒酶的活性檢測(cè)的靈敏度都會(huì)因?yàn)槿拥奈恢貌煌兴町?，總體來(lái)說(shuō)， 使用TRAP檢測(cè)體液樣本的端粒酶活性，從提取、擴(kuò)增至讀取結(jié)果，用時(shí)23 h，僅包含離心、加樣等基本的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)操作，并且可以參考試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)陽(yáng)性及陰性結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單、及時(shí)的判讀，是一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的端粒酶活性檢測(cè)方法。（2） RT-PCR法檢測(cè)hTERT的表達(dá)（3） 用32P標(biāo)記的端粒（CCCTAA）探針

9、或用Hinf1和Ras1酶解的基因組DNA雜交，檢測(cè)端粒的長(zhǎng)度 四、端粒酶在腫瘤治療方面的應(yīng)用正常細(xì)胞中的端粒酶活性檢測(cè)是呈現(xiàn)陰性的，而85%以上惡性腫瘤細(xì)胞中的端粒酶活性是高度表達(dá)的11，這就說(shuō)明，腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性因?yàn)槟承┰虮患せ?，使端粒不斷維持在一定的長(zhǎng)度，細(xì)胞因此逃過(guò)正常的衰亡而成為無(wú)限增殖的細(xì)胞；端粒酶活性與惡性腫瘤之間的密切關(guān)系，為腫瘤的診斷提供了有效的標(biāo)志物12。因此，端粒酶是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細(xì)胞的關(guān)鍵性物質(zhì)，是抗腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。而且，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中端粒酶的表達(dá)、端粒的長(zhǎng)度和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的差異，使得選擇端粒酶作為藥物靶標(biāo)成為相對(duì)安全有效的治療手段13。由于端粒酶活性

10、是通過(guò)TERT基因的轉(zhuǎn)錄機(jī)制來(lái)嚴(yán)格調(diào)控的。通過(guò)克隆TERT基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)區(qū)域，研究者發(fā)現(xiàn)TERT基因啟動(dòng)子是高GC富含區(qū)，缺少TATA盒和CAAT盒。TERT基因核心啟動(dòng)子上存在一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)，如E.box (CACGTG)、SPl、CEsts等。這些結(jié)構(gòu)特征使得TERT基因啟動(dòng)子具有高腫瘤靶向性及較強(qiáng)的啟動(dòng)活性，從而成為腫瘤靶向基因治療中具有巨大潛力的啟動(dòng)子14。 近年來(lái)，針對(duì)端粒酶為作用靶點(diǎn)的抗腫瘤研究非?；钴S，其研究目標(biāo)就是尋找各種有效的途徑來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性，目前主要的途徑有以下幾種15： （一）阻斷端粒酶RNA的模板作用，包括：反義hTR、反義寡核苷酸、錘頭狀核酶和

11、肽苷酸等；我們以反義寡核苷酸為例，講述腫瘤治療中以反義寡核苷酸為靶點(diǎn)的應(yīng)用；研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人端粒酶RNA（human telomerase RNA，hTR）11個(gè)堿基區(qū)域的治療可以直接抑制端粒酶的活性，因此是寡核苷酸治療的理想靶點(diǎn)。不論端粒酶全酶的結(jié)構(gòu)如何，hTR的模板區(qū)域一定會(huì)連接到端粒的重復(fù)結(jié)構(gòu)，因此就會(huì)出現(xiàn)靶寡核苷酸的暴露，這為寡核苷酸介導(dǎo)的治療提供了理論基礎(chǔ)16。有報(bào)道稱以hTR為靶點(diǎn)的反義寡核苷酸可降低胃癌細(xì)胞系SW480（人結(jié)腸癌細(xì)胞株）的活性，并同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡17。 （二）針對(duì)端粒酶催化亞基的抑制劑：反義hTERT抑制劑、端粒酶蛋白抗體、PKC調(diào)節(jié)劑等；目前，對(duì)于端粒酶催化亞基的

12、抑制劑，國(guó)內(nèi)外研究的比較深入的是反義h TERT抑制劑，其抑制腫瘤的機(jī)制是：針對(duì)端粒酶RNA組分中含有與端粒DNA序列互補(bǔ)的堿基模板序列設(shè)計(jì)的反義核苷酸，它具有阻斷其模板的作用，從而抑制DNA端粒酶合成端粒DNA序列。因此，反義hTERT抑制劑可以抑制腫瘤細(xì)胞的端粒酶活性并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明，用反義hTERT轉(zhuǎn)染人Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)端粒DNA逐漸丟失，經(jīng)2326個(gè)分裂周期后細(xì)胞就開(kāi)始死亡18。這一實(shí)例就證明了用端粒酶作為靶點(diǎn)去設(shè)計(jì)端粒酶抑制劑是腫瘤治療的一個(gè)極具前景的新方向。5、 結(jié)語(yǔ)2009年的三位諾貝爾獎(jiǎng)得主為我們揭示了端粒保護(hù)染色體的一系列機(jī)制，以及端粒與細(xì)胞癌變、衰老之間的密

13、切關(guān)系，也為后來(lái)的研究者提供了一個(gè)嶄新的研究端粒酶治療腫瘤方面的思路和研究路線，使我們從染色體的層次深刻的認(rèn)識(shí)了腫瘤細(xì)胞，并且結(jié)合端粒酶在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)特性，為腫瘤的診斷、端粒酶靶向抗腫瘤藥物的研制提供了更高效、專一的位點(diǎn)；盡管越來(lái)越多的端粒酶研究都取得很好的結(jié)果，但是仍然有一些問(wèn)題需要我們?nèi)ソ鉀Q：第一，并不是所有的腫瘤患者和腫瘤類型都能檢測(cè)到端粒酶的活性，因此，這些細(xì)胞可能會(huì)對(duì)端粒酶靶向的治療方法不敏感。第二，當(dāng)端粒酶活性被抑制后，端粒的長(zhǎng)度需要一段時(shí)間縮短至一定程度時(shí)才能引起細(xì)胞凋亡。因此，從藥物治療開(kāi)始到產(chǎn)生一定的治療作用會(huì)有一段時(shí)間的滯后期。第三，腫瘤細(xì)胞常常會(huì)啟動(dòng)其它補(bǔ)償機(jī)制而逃

14、脫治療的壓力，在以端粒酶為靶向的治療中刺激與端粒酶功能相似的其它基因的表達(dá)。這些都是需要我們?nèi)?yīng)用生物技術(shù)解決的問(wèn)題，但是，相信總有一天，人類會(huì)利用端粒酶研究更多的端粒酶抑制藥物，從根本上克服腫瘤。 參考文獻(xiàn)1楊品紅，王志陶，王志勇.端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用.生物技術(shù)通報(bào), 2010 (8):46-5123鐘天映,陳媛媛,畢利軍.端粒與端粒酶的研究解讀2009年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009, 36(10): 1233-12384WATSON J DOrigin of concatemerie T7 DNAJ.Nat NewBioI, 1972, 239(94):197

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