植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定

1、植物基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植物的分析與鑒定實(shí)驗?zāi)康? 了解創(chuàng)建煙草突變體庫的方法；2 理解每種方法的基本原理；3 掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法以及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物篩選和鑒定的基本過程。實(shí)驗原理隨著越來越多植物的全基因組測序工作的完成，在此基礎(chǔ)上開展功能基因組的研究是目前的核心研究內(nèi)容之一。植物插入突變體庫的建立是功能基因組研究的一個重要內(nèi)容，在此基礎(chǔ)上也能進(jìn)行正向遺傳學(xué)及反向遺傳學(xué)的研究。在創(chuàng)制突變體的策略上，傳統(tǒng)方法是使用物理或化學(xué)誘變方法獲得，其優(yōu)點(diǎn)是可在盡可能短的時間內(nèi)獲得飽和突變體。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變方法相比，生物誘變（T-DNA和轉(zhuǎn)座子插人誘變）通?？蓸?biāo)記突變基因，從而較為容易地分離鑒定靶基因

2、。最近數(shù)年，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入突變已成為國際公認(rèn)的植物功能基因組學(xué)的主要研究方法之一。煙草是植物基因組研究的一種模式植物，其突變體庫的創(chuàng)建是煙草功能基因組學(xué)研究中的重要內(nèi)容，其目的是通過大規(guī)模的突變體庫平臺快速全方位的了解基因組中各個基因的功能。突變體的創(chuàng)制是遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，也是分離基因和基因功能鑒定的最要途徑。通過誘導(dǎo)培養(yǎng)，使煙草產(chǎn)生愈傷組織，利用土壤農(nóng)桿菌感染愈傷組織，實(shí)現(xiàn)T-DNA標(biāo)簽在煙草愈傷組織基因組中大量隨機(jī)插人，利用植物細(xì)胞的全能性，經(jīng)過抗性篩選，誘導(dǎo)分化，從抗性愈傷組織獲得煙草突變體再生植株，獲得各突變體的純合材料，從而建立煙草突變體的數(shù)據(jù)庫，然后分析突變性狀與T

3、-DNA的共分離關(guān)系，存在共分離的材料用適當(dāng)?shù)腡ail-PCR克隆技術(shù)獲得T-DNA的側(cè)翼基因組序列，用其作探針篩選基因文庫，獲取目標(biāo)基因或克隆，再進(jìn)行下一步的分析（圖實(shí)驗4-1）。T-DNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物（T1，T-DNA雜合子）收獲T2種子篩選T2，獲突變子，應(yīng)為3:1分離確定T-DNA與突變型共分離的個體產(chǎn)生純合后代克隆T-DNA兩側(cè)的植物DNA（TailPCR）利用側(cè)翼DNA序列作探針從該植物的cDNA文庫中釣取基因基因功能的驗證（遺傳互補(bǔ)測驗，分離的野生基因轉(zhuǎn)化突變體，回復(fù)功能）圖實(shí)驗4-1T-DNA標(biāo)簽克隆基因的基本流程TAIL-PCR分離法是利用多個嵌套的T-DNA插入序列特異

4、性引物（根據(jù)T-DNA中靠近右邊界處的核苷酸序列設(shè)計的引物，Tm值57-62和一個短的隨機(jī)簡并引物（AD，Tm值44-46）組合，以突變體基因組DNA為模板，進(jìn)行多次PCR反應(yīng)，采取高溫特異性擴(kuò)增與低溫隨機(jī)擴(kuò)增相間進(jìn)行的方法，最后獲得T-DNA插入側(cè)翼區(qū)特異性擴(kuò)增片段（實(shí)驗圖4-2），可作為探針，篩選分離基因。TAIL-PCR分離法可以降低非側(cè)翼區(qū)特異產(chǎn)物的背景，同時它可以產(chǎn)生2個以上嵌套的目的片段，與其它方法相比TAIL-PCR方法具有簡便、特異、高效、快速和靈敏等特點(diǎn)，已經(jīng)在擬南芥和水稻等植物中獲得了成功及廣泛的應(yīng)用。實(shí)驗圖4-2TAIL-PCR反應(yīng)流程圖本實(shí)驗用含T-DNA載體質(zhì)粒pCA

5、MBIA1301的LBA4404農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)染煙草愈傷組織，讓T-DNA隨機(jī)插入煙草的基因組中形成T-DNA突變體，通過PCR特異擴(kuò)增HPT基因片段來鑒定轉(zhuǎn)基因煙草，以TAIL-PCR法獲得轉(zhuǎn)基因煙草突變體的側(cè)翼基因片段，測序后將獲得側(cè)翼基因片段的序列與GeneBank中的已知序列對比，獲得功能基因的全序列。儀器、材料和試劑（一）儀器高速冷凍離心機(jī)，PCR儀，超凈工作臺，恒溫?fù)u床，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)箱，紫外可見分光光度計，凝膠成象儀或DarkReader,恒溫水浴鍋，微孔加熱器，電泳儀，水平板電泳槽，天平，酸度計，旋渦混合器。（二）材料煙草幼苗，含T-DNA載體質(zhì)粒pMD83rc的LB

6、A4404農(nóng)桿菌菌株，Ex-taqDNA聚合酶，DNA1kbladdeer，GoldView核酸染料。（三）試劑1.2CTAB提取液100mmol/L Tris-HClpH8.02（w/v）CTAB1.4mol/LNaCl40mmol/Lb-巰基乙醇20mmol/LEDTA2. TE緩沖液10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTA3. 50'TAE極緩沖液1000mlTris54g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20ml4. 10次氯酸鈉5. 氯仿：異戊醇（V:V，24：1）6. 70乙醇7. 溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.HCl

7、（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）100ml8. 溶液III：60ml5mol/L乙酸鉀，11.5ml11.5冰乙酸，28.5ml無菌水100ml9. 溶?夜II:分別配制0.4mol/LNaOH和2%SDS溶液（各30ml）,用時1:1混合10. LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950mL去離子水中加入：胰蛋白胨（bacto-typtone）10g酵母提取物（bacto-yeastextract）5gNaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，加入200uL5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,加入去離子水至總體積為1升，121c高壓滅菌20分鐘。11.MS基本培養(yǎng)基人里兒

8、系mg/L微量元素mg/L有機(jī)營養(yǎng)mg/LNH4NO31650KI0.83甘氨酸2.0KNO31900H3BO36.2煙酸0.5CaCl22H2O440MnS044H2O22.3鹽酸口比哆醇（Vb6)0.5MgSO47H2O370ZnSO47H2O8.6鹽酸硫胺素（Vb1)0.lKH2PO4170NaMoO42H2O0.25肌醇100CoCl26H2O0.025CuSO45H2O0.025FeSO47H2O27.8配制方法母液：大量元素（50X）400mL硝酸俊33g;硝酸鉀38g;磷酸二氫鉀3.4g;七水合硫酸鎂7.4g;鐵元素（100X）200mL七水合硫酸亞鐵0.556g;七水合EDTA

9、二鈉0.746g;有機(jī)營養(yǎng)（100X）200mLGly0.040g;VB10.002g;VB60.010g;肌醇2g;煙酸0.010g;微量元素（1000X）200mL碘化鉀166mg;硼酸1240mg;一水合硫酸鎰3380mg;七水合硫酸鋅1720mg;二水合鋁酸鈉44mg;五水合硫酸銅5mg;六水合氯化鉆5mg;氯化鈣（50X）400mL氯化鈣8.8g12. 愈傷組織誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基0.2mg/L6-BA0.02mg/LNAA3%蔗糖0.6%瓊脂其中6-BA取25mg用少量1MNaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1MNaOH溶解后定容到50mL；2,4-D取

10、50mg用少量1MNaOH溶解后定容到100mL;以上激素母液均為0.5mg/mL13. 篩選培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基0.2mg/L6-BA0.02mg/LNAA3%蔗糖0.6%瓊脂100mg/L羧芐青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL）1gKANA溶于20mL蒸餾水；RIF（50mg/mL）0.25gRIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR（30mg/mL）0.6gSTA溶于20mL蒸餾水；羧芐青霉素（100mg/mL）2g羧芐青霉素溶于20mL蒸餾水。潮霉素B（50mg/mL）可以直接購買實(shí)驗步驟I煙草外植體的無菌培養(yǎng)和誘導(dǎo)再生1. 煙草葉片預(yù)培養(yǎng)：取煙草完全展開的幼葉，

11、用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺中將葉片浸于70%酒精中30秒，然后移入10%的次氯酸鈉溶液中510分鐘（消除外植體表面的微生物）。無菌水至少洗滌3次（消毒液對外植體有很大傷害，必須清洗干凈），每次停留35min。將無菌葉片剪成0.5cmX0.5cm大小塊或用6mm打孔器鑿成圓盤。2. 煙草葉片的誘導(dǎo)再生：自行設(shè)計MS培養(yǎng)基中的NAA、6-BA植物激素濃度，誘導(dǎo)煙草葉片生根或生芽；將上述處理過的無菌葉片接種在含有不同濃度植物激素的MS固體培養(yǎng)基中，每周定期觀察并更換培養(yǎng)基。II轉(zhuǎn)基因煙草的培養(yǎng)1. 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：將含T-DNA載體的農(nóng)桿菌單菌落接種到20mlLB液體培養(yǎng)基中（Kana50ug/m

12、l、RIF、STR），27，180rmin振搖培養(yǎng)過夜。將2ml菌液轉(zhuǎn)入20mlLB液體培養(yǎng)基中，與上述的相同條件培養(yǎng)6小時左右，使菌液達(dá)到OD600=0.20.5,用來侵染煙草葉片。2. 煙草葉片預(yù)培養(yǎng)：取煙草完全展開的幼葉，用自來水洗凈晾干。在超凈工作臺中將葉片浸于70%酒精中30秒，然后移入10%的次氯酸鈉溶液中510分鐘（消除外植體表面的微生物）。無菌水至少洗滌3次（消毒液對外植體有很大傷害，必須清洗干凈），每次停留35min。將無菌葉片剪成0.5cmX0.5cm大小塊或用6mm打孔器鑿成圓盤。3. 愈傷組織轉(zhuǎn)化：在80r/min搖床上旋轉(zhuǎn)浸染510分鐘。將葉外植體置于無菌濾紙上吸去多

13、余的菌液（如果葉片粘附細(xì)菌過多，可以在無菌水中漂洗12次）。4. 共培養(yǎng)：將侵染過菌液的葉片接種在MS愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基上，在26黑暗條件下共培養(yǎng)3天。5. 篩選培養(yǎng)與分化：將共培養(yǎng)處理的煙草葉片轉(zhuǎn)移到凝固后的篩選培養(yǎng)基上（100ug/L羧芐青霉素和50ug/L潮霉素B，羧芐青霉素起到抑制農(nóng)桿菌生長的作用。如果農(nóng)桿菌生長未被抑制，農(nóng)桿菌將抑制葉外植體的生長）。每隔34天繼代一次，培養(yǎng)條件為，光照2000lx，溫度26，日照16h。4周后轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分裂生長形成大量愈傷組織并有根、芽分化。接種煙草葉片于無激素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，同時作為對照實(shí)驗（無愈傷組織生長和器官分化）。m轉(zhuǎn)

14、基因煙草的檢測1. 剪取培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化煙草和前期實(shí)驗未轉(zhuǎn)基因煙草葉片小片，液氮中研磨至粉末狀，加入0.5mL65預(yù)熱CATB抽提液65水浴抽提30min，間歇混勻；2. 取上清各加入0.5mL氯仿異戊醇（體積比24:1）去除蛋白，12000rpm離心10min；3. 取上清加入1體積預(yù)冷異丙醇至-20C出沉淀3060min,8000rpm離心15min;4. 棄上清，70%乙醇洗滌2次干燥，避光保存；5. 加入15dL蒸儲水溶解并電泳檢測（0.7%瓊脂糖凝膠電泳）；6. 提取pMDC83rc質(zhì)粒：(1) 3-5ml過夜菌12000rpm離心1min,棄上清；(2)加300。預(yù)冷溶液I,顛倒混勻6

15、-8次；(3)加300W新鮮不預(yù)冷溶液II,顛倒混勻6-8次；(4)加300口預(yù)冷溶液III,顛倒混勻6-8次；(5)12000rpm15min,轉(zhuǎn)移上清液；(6)加入0.5倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置3min,如上離心12min;(7)棄上清，70%乙醇洗沉淀；(8)空氣干燥，20ml蒸儲水溶解，-20C貯存。7.對提出的基因組DNA進(jìn)彳TPCR擴(kuò)增；引物和擴(kuò)增體系同上述的PCR步驟；GFP引物GFP-F:5'-GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3',GFP-R:5'-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3'(1)在0.2mlPCR管中，按照下表配制PCR反應(yīng)體系(25D。尤由水10XPCRBufferdNTPMixtureGFP-FGFP-REx-Taq模板DNA14.2ul2.5L1(1L0.5(1L0.5L0.3妙1ul(2)按如下程