馬兜鈴酸體內檢測方法及代謝轉化研究

1、馬兜鈴酸體內檢測方法及代謝轉化研究項目完成單位：國家藥物及代謝產物分析研究中心項目完成人： 李亞偉摘 要 建立了簡單、靈敏的高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的方法。馬兜鈴酸I和內標吲哚美辛經乙酸乙酯液-液萃取后，用HPLC法進行分析。色譜柱為YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流動相為乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 檢測波長254nm。藥代動力學研究表明大鼠口服馬兜鈴酸I后吸收很快，消除較慢，藥-時曲線消除相存在有多峰現象，按非房室模型計算藥代動力學參數。并且在血漿中發(fā)現了一個可能

2、的馬兜鈴酸I代謝產物。我們采用正、負離子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多種質譜分析方法對馬兜鈴酸I及其代謝物進行了探索研究，但是由于馬兜鈴酸I離子化困難，離子化效率低，未得到理想的結果。然后我們通過往流動相中加入醋酸銨以及改變多種流動相體系等措施使馬兜鈴酸的離子化效率有所改善，從而分析研究了馬兜鈴酸的M+NH4+離子在LC-MS/MS譜上的裂解方式，并檢測到可能是馬兜鈴內酰胺Ia的硫酸結合型II相代謝產物。但是本質譜分析方法還有待于進一步的改進。一、 研究背景近年來，歐洲學者報道了一系列含有馬兜鈴酸（Aristolochic acid, AA）的中草藥導致腎損傷的病例，并將此稱為“中草

3、藥腎病”。目前，這一發(fā)現已經引起國內外學者的廣泛關注，從而開始對AA所致腎損傷的臨床表現及病理機制進行深入的研究。AA是馬兜鈴屬植物中的主要成分，該屬植物分布廣泛，在我國有40多種，其中有些是常用中藥，如馬兜鈴、關木通、廣防己、青木香、天仙藤、尋骨風等。在一些減肥中藥中，由于使用了含有AA的馬兜鈴屬植物，特別是誤將關木通、廣防己用作為有利尿作用的木通，從而造成使用者腎臟功能損害，其臨床表現是貧血和高血壓，腎功能呈“亞急性”或“快速進展性”的不可逆損傷，停藥后仍不能逆轉，往往在數月或12年內發(fā)展為終末期腎病，嚴重者可致腎功能衰竭。醫(yī)生建議在使用一些含有AA的中草藥時應特別慎重，嚴防腎損傷的發(fā)生。

4、目前有關AA引起腎損傷的機制尚不十分清楚，它在人體內的吸收、分布、代謝及消除過程也未被充分闡明3。因此，研究AA的體內檢測方法，了解其體內過程及藥代動力學特點，將有助于深入研究其毒理機制，從而為其毒副作用的防治提供理論依據。另一方面，若能對患者體內的AA水平進行有效而準確的監(jiān)測，則有可能對毒副反應的發(fā)生起到預警作用，最大限度地避免悲劇的重演。因此，AA的體內檢測方法及代謝研究具有十分重要的理論和實際價值。近二十年來，除了有少量植物中AA的HPLC分析研究外，國內外有關AA體內分析方法的文獻報道幾乎沒有。其藥物動力學研究系采用紫外分光光度法，顯然無論靈敏度和特異性均不能符合要求；而代謝產物的研究

5、則是從生物樣品中分離制備代謝物純品，這樣往往可能遺漏含量較低的代謝物。因此我們擬采用HPLC、LC-MS、GC-MS等技術，研究建立AA在生物樣品中新的分析方法，使其具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點，并符合藥物動力學研究和臨床藥物監(jiān)測的需要，為全面研究AA的毒理機制、控制毒副反應的發(fā)生提供方法學基礎，從而為中藥現代化、科學化進程作出貢獻。二、馬兜鈴酸體內檢測方法及代謝轉化研究策略建立了簡單、靈敏的高效液相色譜法（HPLC）測定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的方法。以SD種雄性大鼠作為研究對象，研究了大鼠單次口服馬兜鈴酸I溶液后其藥代動力學行為。另外采用正、負離子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多種

6、質譜分析方法對馬兜鈴酸I及其代謝物進行了探索研究。具體實驗設計如下：1、以SD種雄性大鼠作為研究對象，體重210±20g。 2、配制馬兜鈴酸I（1.00 gL-1）和內標物吲哚美辛（1.00 gL-1）的標準儲備液。3、藥代動力學實驗部分所使用的液相條件：色譜柱為YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流動相為乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 檢測波長254nm。4、對血漿中的馬兜鈴酸I和內標吲哚美辛使用重蒸乙酸乙酯進行液-液萃取。5、對分析方法按有關規(guī)范要求進行了平均方法回收率、精密度與準確度和穩(wěn)

7、定性的考察。6、研究了大鼠單次口服馬兜鈴酸I溶液后其藥代動力學行為。 7、以苯巴比妥鈉誘導大鼠，制備大鼠肝微粒體。8、對馬兜鈴酸I進行大鼠體外肝微粒體溫孵體系中的代謝進行研究。用HPLC法對大鼠體外代謝產物進行分析。9、生物樣品收集：大鼠（n=4）在給藥前均禁食12小時，以含5%蔗糖的生理鹽水維持，同時收集空白尿和糞。給藥后收集0-24小時及24-72小時尿和糞。大鼠（n=4）禁食12小時后，做膽汁引流手術，觀察3小時，同時收集空白膽汁，然后口服灌胃給藥，收集0-24小時及24-72小時膽汁。10、建立馬兜鈴酸I在大鼠體內外代謝的生物樣品前處理辦法。11、我們采用正、負離子化模式的ESI-MS

8、、APCI-MS等多種質譜分析方法對馬兜鈴酸I及其代謝物進行了探索研究，并檢測到可能是馬兜鈴內酰胺Ia的硫酸結合型II相代謝產物。三、馬兜鈴酸I在大鼠血漿中的藥代動力學研究馬兜鈴酸I（Aristolochic acid I，AAI）和內標物吲哚美辛（Indomethacin）的結構式分別為以下所示： Aristolochic acid I IndomethacinFig. 3-2 Structures of AAI and Internal Standard (Indomethacin)1 儀器與材料 1.1 藥品與試劑 馬兜鈴酸I對照品（鑒別用，純度>95%） 中國藥品生物制品檢定所吲

9、哚美辛（含量測定用） 中國藥品生物制品檢定所肝素鈉 常州新華活性材料研究所碳酸氫鈉（分析純） 北京化工廠乙腈（色譜純） Merck公司甲醇（色譜純） Merck公司 冰醋酸（分析純） 北京化工廠乙酸乙酯（分析純） 北京化工廠雙蒸水 北京協和藥廠1.2 動物 SD大鼠，體重210±20g， 北京維通利華實驗動物公司提供, 許可證號：9CXK（京）2002-0003。 1.3 儀器 日本Jasco公司高效液相色譜儀（PU-980泵，UV-975檢測器）；SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數據處理系統；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；TTM-1

10、型旋渦混合器（日本SIBATA公司）；天平（LIBROR AEL-160型，Shimadzu公司；AG135型，METTLER TOLEDO公司）；微量移液器（40-200 µL，NICHIRYO公司；100-1000 µL，GILSON公司）。1.4 試藥的配制 稱取10.00 mg馬兜鈴酸I，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解超聲促溶，配成1 gL-1的馬兜鈴酸I標準儲備液。然后根據需要進行不同倍數的稀釋，配制成相當于濃度為0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1馬兜鈴酸I的系列標準溶液。稱取20.0 mg馬兜鈴

11、酸I，用1% NaHCO3溶液溶解，超聲促溶，配成1.0 gL-1的溶液供大鼠口服。肝素鈉用生理鹽水配成4 gL-1的溶液。稱取內標吲哚美辛5.00 mg，配成濃度為1.00 gL-1甲醇溶液作為儲備液，準確轉移0.75 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋為0.015 gL-1 的內標供試液。2 方法與結果2.1 血漿樣品處理 取大鼠血漿0.2 mL，置于10 mL具塞離心管中。加入內標溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）200 L，混勻。加入乙酸乙酯3 mL，渦流震蕩1 min，離心10 min （3000r·min-1），分取上層有機相。同法用乙酸乙酯再提

12、取一次合并有機相，于40氮氣流下吹干，殘留物溶于200 L流動相中，渦流1 min，離心后取上清液20 L進行HPLC分析。2.2 色譜條件和色譜行為色譜柱：YMC C18柱（5 m，3.0 mm×150 mm I.D.）流動相：乙腈-水-冰醋酸（50:50:1），流速： 0.3 mL·min-1, 檢測波長254nm。在上述色譜條件下，空白血漿、含藥血漿和實測血漿的HPLC譜圖如Fig.3-3所示。結果顯示馬兜鈴酸I和內標吲哚美辛的色譜峰不受內源性雜質峰的干擾，色譜分離良好（R>1.5），測定專屬性強。馬兜鈴酸I的保留時間為11.87min，內標吲哚美辛的保留時間為

13、16.88min，色譜峰3可能為馬兜鈴酸I的一個代謝產物，其保留時間為5.77min。 (A) (B) (C)Fig.3-3 HPLC chromatograms of blank plasma(A), standard plasma(B) and test plasma(C).A: Blank plasma sample.B: Plasma sample spiked with 5g·mL-1AAI(1) and internal standard(2).C: 0.167h plasma sample after an oral administration of AAI(po.1

14、0 mg·kg-1) to a SD rat, a possible metabolite(3) of AAI. Internal Standard: Indomethacin2.3 標準曲線與線性范圍 取大鼠空白血漿0.2 mL，置于10 mL具塞離心管中，加入馬兜鈴酸I系列標準溶液200 L，分別配制成相當于濃度為0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1的血漿樣品，按照上述方法中“血漿樣品處理”項下操作，建立標準曲線。以血漿中待測物濃度（C）為橫坐標，待測物與內標物的峰面積之比（Y）為縱坐標，進行回歸計算，求得直線回歸方程

15、，建立標準曲線。回歸方程為Y=0.0946C-0.0172，=0.9994，標準曲線見Fig.3-4。本方法在0.25-20.00g·mL-1范圍內線性良好，最低定量濃度為0.25g·mL-1。Fig.3-4 A typical standard curve for the determination of AAI in rat plasma2.4 方法回收率分別取低、中、高3個濃度（0.25、2.50、20.00g·mL-1）的標準系列溶液，按“標準曲線與線性范圍”項下方法操作，所測得的馬兜鈴酸I色譜峰面積值與標準溶液直接進樣分析所得的面積值對比，考察各濃度點的

16、平均方法回收率。每一濃度進行5樣本分析。結果見Tab.3-1。Tab.3-1 The relative extracted percentage of AAI at three different concentrationAdded(g·mL-1) 0.25g·mL-1 2.50g·mL-1 20.00g·mL-1Measured 0.28 2.62 20.34 (g·mL-1) 0.26 2.57 21.55 0.26 2.63 20.13 0.25 2.66 21.95 0.27 2.32 21.50 (g·mL-1) 0.26

17、 2.56 21.09RE(%) 4.72 2.40 5.47RSD(%) 4.67 5.39 3.82 2.5 精密度與準確度取空白血漿0.2 mL，按“標準曲線與線性范圍”項下方法操作，分別制備濃度為0.25、2.50和20.00g·mL-1的馬兜鈴酸I待測樣品，每一濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定2天，以標準曲線計算樣品濃度，求算精密度與準確度，結果見Tab.3-2。精密度與準確度均符合有關國內外規(guī)范要求。Tab. 3-2 Precision and accuracy of the HPLC method to determine AAI in rat plasmaConcentr

18、ation0.25g·mL-12.50g·mL-120.00g·mL-1Inter-day（n=5） (g·mL-1)0.26 0.260.240.260.263.09 2.82 2.732.65 2.7119.94 20.16 21.18 20.45 21.20(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.26 2.32 3.552.80126.1820.592.932.90Inter-day（n=5）(g·mL-1)0.27 0.27 0.25 0.240.242.88 2.56 2.67 2.35 2.6521.12 19.03

19、20.84 20.96 21.01(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.25 1.36 6.012.80126.1820.592.94.272.6 樣品穩(wěn)定性考察 考察馬兜鈴酸I的高（20.00g·mL-1）、低（0.25g·mL-1）不同濃度的樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性。結果表明血漿樣品在冷凍-融化循環(huán)3次實驗中測定的馬兜鈴酸I的濃度沒有明顯降低（相對偏差在10%以內）。室溫條件下馬兜鈴酸I在流動相中至少穩(wěn)定存在24h。2.7 馬兜鈴酸I在大鼠體內藥代動力學研究雄性SD大鼠5只，每只大鼠間隔一定的時間取血，取血時間點為0.017，0.083，0.13，0

20、.20，0.25，0.42，0.58，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0h。給藥前禁食12h，全程不禁飲水。大鼠灌胃口服1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0gL-1），劑量為10.0 mg·kg-1，于不同時間點由大鼠眼眶后靜脈叢取血約500 L，置于肝素化離心試管中，離心分離血漿，按上述方法中“血漿樣品處理”項下操作，測得大鼠單次口服馬兜鈴酸I后各個采血點的血藥濃度，數據見Tab.3-3。平均血藥濃度-時間曲線如Fig.3-5所示。體內結果表明大鼠口服馬兜鈴酸I后藥-時曲線存在有多峰現象。用WINNOLIN藥代計算程序處理，按照非房室模型進行推算

21、、權重選擇，擬合藥-時曲線，并計算相關藥代參數，有關藥代動力學參數見Tab.3-4。Fig.3-5 Mean plasma concentration-time curve of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTab.3-3 Plasma concentration of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTime(h)12345MeanSD0.03330.08330.11670.18330.250.43330.58330.7511.522

22、.5340.538.1110.999.539.104.181.612.756.711.961.301.051.880.750.314.327.028.637.193.261.697.096.481.720.750.450.410.340.434.828.5310.1311.142.931.691.165.792.630.830.500.380.350.295.717.368.3810.122.061.012.271.332.220.830.500.420.296.9714.3812.4428.0019.6411.655.261.871.190.580.460.410.460.375.999.6

23、69.8213.116.413.533.714.441.940.860.620.720.460.111.563.071.628.457.434.552.422.620.540.270.290.650.16Tab.3-4 Pharmacokinetic parameters of AAI after single oral dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsSubject Rsq Tmax Cmax AUClast AUC0 T1/2_z Vz/F Cl/F AUMC0 MRT0 (observed) (observed) (observed) (observed

24、) (observed) h ug·mL-1 mg·h·L-1 mg·h·L-1 h 1 0.624 0.117 10.99 10.66 12.00 1.246 0.449 0.250 21.467 1.7892 0.769 0.183 8.63 8.73 9.10 0.755 0.359 0.330 10.425 1.1463 0.817 0.250 11.14 8.21 8.57 0.722 0.365 0.350 10.020 1.1694 0.772 0.250 10.12 6.41 7.25 1.382 0.825 0.414 11.

25、833 1.6325 0.706 0.300 28.00 13.82 14.77 1.437 0.421 0.203 14.885 1.008 0.737 0.22 13.77 9.57 10.34 1.108 0.484 0.309 13.726 1.349SE 0.075 0.071 8.013 2.819 3.025 0.345 0.195 0.083 4.730 0.3413 討論3.1 HPLC分析方法中各種影響因素的條件摸索利用高效液相色譜儀對馬兜鈴酸I的色譜峰進行了全波長掃描，發(fā)現馬兜鈴酸I的最大吸收波長與文獻7報道基本接近：其最大吸收波長位于250nm、318nm、390nm處

26、，實驗中為了避免雜質峰的干擾，同時兼顧最大吸收，保證其靈敏度，所以選擇254nm為檢測波長。 文獻8-10報道的檢測馬兜鈴酸的流動相組成有：甲醇：水：乙酸=70:29:1(v/v/v)；乙腈：0.1%磷酸緩沖液=60:40(v/v)，pH 2.5-2.8；乙腈：0.3%碳酸銨溶液=25:75(v/v)，pH 7.5。本實驗參考以上流動相組成，對其進行了改進，使流動相組成適合生物樣品分析要求，并且滿足下一步LC-MS法對馬兜鈴酸生物樣品的分析要求。本實驗中在微徑柱上使用甲醇/水/乙酸流動相組成體系時，需要將乙酸加至2%才能將保留時間調整合適，考慮到酸性太強會使柱壽命降低，所以未選用此體系。摸索發(fā)

27、現將乙腈/0.3%碳酸銨溶液體系調整比例為27:73（v/v）適合馬兜鈴酸I的分析，但是在此流動相組成下內標物吲哚美辛的色譜峰出現多峰現象，原因不明。最后選擇的流動相組成為乙腈：水：乙酸=50:50:1（v/v/v），在此條件下馬兜鈴酸I和內標吲哚美辛的保留時間合適，適合生物樣品分析的要求，分離良好，內源性雜質不干擾。3.2 內標物的選擇在內標物的選擇上，考察了包括馬兜鈴酸II和一些與馬兜鈴酸結構較為相似的化合物的色譜行為以及提取回收率和穩(wěn)定性，其中馬兜鈴酸II的保留時間和原藥馬兜鈴酸I在本實驗所使用的液相條件下保留時間比較接近，分離度不是特別理想。萘的保留時間合適，與馬兜鈴酸I也 較為接近，

28、分離度良好，但是在按照上述方法中“血漿樣品處理”項下操作過程中，萘的揮發(fā)性較強，分取上層有機相，于40氮氣流下吹干，殘留物復溶后進行HPLC分析時，未出現萘的色譜峰。綜合考慮待選化合物的保留時間以及與原藥相同的提取體系下待選內標物的回收率和穩(wěn)定性等因素，最后選定吲哚美辛為內標物。3.3 提取溶劑的選擇取大鼠空白血漿0.2 mL，加入內標溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）和馬兜鈴酸I （0.0025 g·L-1甲醇溶液）各200 L，考察了不同的提取溶劑體系對回收率和穩(wěn)定性的影響，比較了用重蒸乙酸乙酯、重蒸乙酸乙酯-異丙醇（1:9）、二氯甲烷-異丙醇（9:1）的

29、液-液提取方法。另外還考察了加入氯化鈉固體、甲醇、不同濃度鹽酸酸化對提取回收率的影響。結果表明內標的甲醇溶液具有沉淀蛋白的作用，直接用乙酸乙酯做為提取體系的溶劑提取回收率和穩(wěn)定性很合適，加入鹽酸酸化并沒有使提取率有明顯的增加，為了簡化操作步驟，直接利用乙酸乙酯作為液-液提取體系。3.4 馬兜鈴酸I在大鼠血漿中的藥代動力學行為本研究采用RP-HPLC法測定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的過程中，發(fā)現保留時間為5.77 min的色譜峰可能為馬兜鈴酸I的一個代謝產物，見色譜圖Fig.3-3（C）。對此色譜峰和馬兜鈴酸I的色譜峰進行紫外全波長掃描，其結果見Fig.3-6。經過對比發(fā)現兩者的紫外吸收譜型非常相

30、似，且最大吸收波長也很接近。并且通過與空白血漿對照，初步可以判斷其為馬兜鈴酸I的一個代謝產物。但是由于馬兜鈴酸I及其代謝產物在各種離子化條件下，包括電噴霧質譜（ESI-MS）和大氣壓化學電離（APCI-MS），其離子化效率均很低，所以相應的質譜分析方法尤其是LC-MS或GC-MS方法尚未建立起來，將血漿樣品進行LC-MS和GC-MS方法分析時，可能的代謝產物沒有被檢測出來。為進一步確定這個可能代謝物的結構，將剩余的血漿樣品合并后，裝入自制的正相硅膠柱，使用氯仿、丙酮、異丙醇、甲醇、含1%冰醋酸的甲醇進行洗脫，經減壓濃縮蒸干，復溶于流動相中，利用RP-HPLC進行分析，發(fā)現可能的代謝物在正相硅膠

31、柱上產生死吸附，沒有被洗脫下來。大鼠口服馬兜鈴酸I后吸收很快，T1/2_z為1.108h，消除較慢。本研究首次發(fā)現大鼠口服馬兜鈴酸I后消除相存在多峰現象。藥物的多峰現象一般與腸-肝循環(huán)、胃-腸循環(huán)或腸-腸循環(huán)有關。腸-肝循環(huán)受食物影響明顯，在禁食給藥后再攝取食物的情況下出現，這可能是因為攝食使得儲存于膽囊中的藥物隨膽汁釋放入腸道又被重新吸收的緣故。在本實驗中由于大鼠被采血的時間較密集，所以給藥后大鼠就被供給食物了，所以馬兜鈴酸I在大鼠體內的多峰現象有可能與腸-肝循環(huán)有關。這一結論有待于進一步研究來驗證。 (A) (B)Fig.3-6 The UV spectra of AA I (A) and

32、 the possible metabolite of it (B)四、馬兜鈴酸I代謝產物的質譜分析方法探討1 試劑與儀器1.1 試劑與藥品 馬兜鈴酸I對照品（鑒別用，純度>95%） 中國藥品生物制品檢定所 馬兜鈴酸混合物 Sigma 公司6-磷酸葡萄糖（G-6-P） Sigma公司6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-P DH） Sigma公司氧化型輔酶II（NADP） Sigma公司還原型輔酶I（NADH） 北京百泰生化試劑公司 乙腈（色譜純） Merck公司甲醇（色譜純） Merck公司 冰醋酸（分析純） 北京化工廠雙蒸水 北京協和藥廠1.2 儀器高效液相色譜系統：日本Jasco公司（PU

33、-980泵，UV-975檢測器） SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數據處理系統質譜儀1： AutoSpec Ultima-Tof串聯質譜儀（Micromass，UK）質譜儀2： LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司） HPLC系統：Autosample Surveyor MS Pump Surveyor2 研究方法2.1 生物樣品的收集 體外溫孵體系的建立 采用大鼠肝微粒體體外有氧溫孵體系，結合文獻報道，考察了微粒體蛋白和馬兜鈴酸I的量對代謝轉化率的影響，以便選擇最佳溫孵體系，體外溫孵是在生理溫度37下進行，整個系統用pH7.4 Tris

34、-HCl緩沖液維持pH值穩(wěn)定。 往適量的pH7.4 Tris-HCl緩沖液中按Tab.3-6所示的濃度分別加入肝微粒體、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl2后搖勻，置于37水浴中預溫孵3分鐘，加入適量經DMSO助溶的馬兜鈴酸I溶液，繼續(xù)置于37水浴中振搖，每20分鐘通氧氣1分鐘，2小時后撤離水浴，終止反應。空白對照管不加馬兜鈴酸I，其它操作與樣品管相同，沸水浴滅活。Tab.3-6 Incubation systems with rat liver microsomes and cofactor solution（10ml）GroupNADPmmol/LNADHmmol

35、/LG-6-Pmmol/LG-6-PDHI.U./mLMg2+mmol/LMicrosomeProteinmg/mL AAImg123451.01.01.01.01.00.50.50.50.50.510.010.010.010.010.01.01.01.01.01.04.04.04.04.04.02.03.04.03.03.0 1.0 1.0 1.0 1.52.0 尿液和糞便的收集 SD雄性大鼠5只置于代謝籠中，禁食12小時，10%蔗糖溶液維持，收集24小時空白尿液和糞便，然后給大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0 g·L-1），劑量按體重計算為10.0 m

36、g·kg-1，分別收集0-24小時的尿液和0-72小時的糞便，-20下保存。 膽汁的收集SD雄性大鼠手術前禁食12小時，乙醚麻醉狀態(tài)下做膽管插管手術，10%蔗糖生理鹽水灌胃維持。給藥前收集空白膽汁，然后給大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0 g·L-1），劑量按體重計算為10.0 mg·kg-1，收集給藥以后的膽汁，在-20下保存。2.2 生物樣品的前處理 體外溫孵產物的前處理 溫孵產物用乙酸乙酯10 mL提取，提取三次，合并有機相，于40減壓蒸干，用流動相（甲醇：水=60:40）200 L復溶，離心后取上清液20 L進行HPLC分析。

37、尿液和糞便的前處理 將給藥后收集的大鼠糞便研磨成粉末狀，置于燒杯中，加入乙醇：水（50:50）混合溶劑300 mL浸泡過夜，過濾，殘渣再加入同樣溶劑提取一次，合并濾液。將大鼠糞便濾液和尿液分別于40減壓濃縮，濃縮至小體積后，用反相C18硅膠拌樣，涼干。 按1:25比例，取反相C18硅膠自行裝柱，將硅膠填實，先用甲醇沖洗柱子，然后再用雙蒸水沖洗，樣品填入柱子后先用大量的雙蒸水沖洗，然后用乙腈和水進行梯度洗脫，梯度洗脫流程如下：乙腈（mL）: 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.5 5.5 7.5 10 16雙蒸水（mL）: 49.0 48.5 48.0 47.5 47.0 46.

38、5 45.5 44.5 42.5 40 34最后使用甲醇和含1%冰醋酸的甲醇沖洗，每份50 mL，分別于40減壓蒸干，用流動相（甲醇：水=5:95或15:85）進行復溶，離心后取上清液進行HPLC分析。 膽汁的處理 將收集的大鼠空白膽汁和給藥膽汁分別用乙酸乙酯提?。w積比為1:2），提取三次，合并有機相，于40減壓蒸干，用流動相（甲醇：水=60:40）進行復溶，離心后取上清液進行HPLC分析。2.3 分析方法2.3.1 RP-HPLC分析方法 色譜條件色譜儀：Jasco公司PU-980泵，UV-975檢測器，SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數據處理系統色譜柱：YMC

39、C18柱（5m, 3.0 mm×150 mm I.D.）流速：0.3 mL·min-1 檢測波長：254nm進樣量：20µl流動相1：甲醇：水：冰醋酸=5:95:1流動相2：甲醇：水：冰醋酸=10:90:1 流動相3：甲醇：水：冰醋酸=15:85:12.3.2 質譜分析方法質譜條件儀器型號：AutoSpec Ultima-Tof 串聯質譜儀EI-MS：電離電壓：70eV；分辨率：1000；加速電壓：8000VFAB-MS：Cs+離子槍；分辨率：1000；加速電壓：8000V 基質：甘油（Gly或G），間硝基芐醇（m-NBA） 硫代甘油（TG），二硫蘇糖醇（DTT）

40、 ESI-MS：錐體電壓： 20V 毛細管電壓： 8.5KV 加速電壓： 4KV 溶劑體系： 甲醇-醋酸銨（100:1） 流速： 20 µLmin-1 APCI-MS：Needle voltage: 60V Sampling Cone: 20V Skimmer Lens: 43.2V Ring Electrode: 18.1% Nebulizer Heater: 80 Solution: Methanol Flow Rate: 1.0 mLmin-1GC-MS: 色譜柱： DB-5（30m×0.25mm I.D.，0.25µm）毛細管柱 載氣： He，1mLmin

41、-1 進樣口溫度：220；接口溫度：220；離子源溫度：220進樣方式：不分流，1 µL柱升溫程序：60 (2min) 20/min 220 (1min) 3/min 280(1min)10/min 300 (1min)儀器型號：LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司）ESI-MS: Spray voltage： 4.2 kv Sheath Gas Flow Rate： 40 psi Tube lens offset： 30 Capillary voltage： 3.00V Capillary temperature： 220Solution: Metha

42、nol APCI-MS: Vapouriser temperature： 450 Capillary temperature： 150 Needle current： 5 µAAuxiliary Gas Flow Rate: 20 psiSolution: MethanolLC-MS: 色譜柱： YMC C18柱（5m，3.0 mm×150 mm I.D.）流動相： 乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）流速： 0.3 mL·min-1 樣品處理：馬兜鈴酸I溶于甲醇-醋酸銨（100:1）溶劑體系3 實驗結果與討論3.1 馬兜鈴酸I的質譜分析馬兜鈴酸I標準品在EI-MS

43、譜（Fig.3-8）中得到分子離子m/z 341和碎片離子m/z 295、m/z 293和m/z 278，其中m/z 295為M-NO2+，而m/z 293和m/z 278分析判斷為雜質峰。Fig.3-8 EI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spectrometer在FAB-MS的正、負離子模式下，嘗試使用各種底物，均沒有得到分子離子峰。采用APCI離子化方式，分別在AutoSpec Ultima-Tof串聯質譜儀和LCQ質譜儀上，均沒有檢測到馬兜鈴酸I的分子離子峰。利用AutoSpec Ultima-Tof串聯質譜儀分析檢測馬兜鈴酸I的 ESI-MS譜，見Fig.3-9。結果發(fā)現有多個加合離子，例如M+ Na +( m/z 364)，2M+Na+( m/z 705)，3M+Na+( m/z 1046)和4M+Na+( m/z 1387)。但是可以看出馬兜鈴酸I在正離子模式的ESI電離方式下也很難離子化，同時此結果也表明馬兜鈴酸I具有較強的分子間相互作用力。Fig.3-9 ESI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spec