二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細胞模型的最佳條件篩選

1、二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆細胞模型的最佳條件篩選        【摘要】     目的 確定二苯乙烯苷含藥血清作用于老年性癡呆(AD)細胞模型的最佳條件。方法 利用細胞計數(shù)、MTT方法確立淀粉樣蛋白(A)25-35片段在建立AD細胞模型時的濃度及篩選二苯乙烯苷含藥血清作用的最佳濃度，分別觀察不同濃度血清及不同濃度A25-35對AD細胞模型存活率的影響。結(jié)果 各種血清以5%濃度組的細胞存活率最高。在5%血清濃度下，A25-35 0mol/L和5mol/L濃度組

2、中各含藥血清組細胞存活率均明顯高于正常大鼠血清組(P<0.05或P<0.01)，但在10mol/L A25-35濃度時差異無顯著性。結(jié)論 選用5mol/L A25-35及5%血清濃度建立NG108-15 AD細胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下能客觀地評價二苯乙烯苷含藥血清的藥效。     【關(guān)鍵詞】  二苯乙烯苷 癡呆 老年性 淀粉樣蛋白 NG108-15細胞    The optimum conditions for screening of TSG-containing serum

3、 affect on cell model of Alzheimer's diseaseHUANG Zhong-Shi, ZHANG Shu-qiu, NONG Song, LI Tao, LI Shu-boDepartment of Biochemistry, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China    Abstract:  Objective  To confirm the optimum conditions of TSG-

4、containing serum affect on cell model of Alzheimer's disease (AD).  Methods  Cell counting and MTT technique were used to determine the optimum concentration of amyloid 25-35(A25-35) and drug-containing serum in establishing cell model of AD, then observed the cell survival rate of the

5、 cell model after treated with different concentration of rat's serum and of amyloid 25-35, respectively.  Results  5% concentration of serum resulted  in the highest cell survival rate among all kinds of serum. At the 5% concentration of serum condition, the cell survival rate of

6、 drug-containing serum groups were higher than the normal serum group at 0mol/L and 5mol/L concentration of A25-35 (P<0.01), but had no difference at 10oml/L concentration.  Conclusions  It is the optimum condition to select 5mol/L concentration of A25-35 and 5% concentration of drug-co

7、ntaining serum to establish the NG108-15 cell model of AD and the best system to assess the drug efficacy. Under these conditions can be objectively assessed the drug efficacy of TSG-containing serum.Key words:  2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-B-D-glycoside; dementia, senile; amyloid bet

8、a-protein; NG108-15 cells      用動物模型研究老年性癡呆（AD）能夠反映整體水平的變化以及行為和記憶功能的改變，但由于體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，對某些特殊類型細胞功能及細胞結(jié)構(gòu)、酶、離子及其通道、受體的研究卻較困難。動物細胞的體外培養(yǎng)成功彌補了這一缺陷。利用細胞培養(yǎng)法建立AD細胞模型已經(jīng)成為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究AD的重要手段1,2。我們將淀粉樣蛋白(A)25-35作用于NG108-15神經(jīng)細胞，建立AD細胞模型，研究二苯乙烯苷（2, 3, 5, 4-tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glycoside,

9、 TSG）含藥血清對AD細胞模型的影響。本實驗主要探討建立AD細胞模型的A25-35的最佳濃度和二苯乙烯苷含藥血清的最佳作用濃度，觀察在不同濃度A25-35和不同濃度二苯乙烯苷含藥血清的細胞存活率?，F(xiàn)報道如下：1  材料1.1  動物健康3月齡Wistar大鼠60只，雌雄兼用，體重200250g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SCXKG桂2003-0003，實驗動物使用許可證：SYKG桂2003-0005）。1.2 主要藥品與試劑 二苯乙烯苷：由本教研室根據(jù)有關(guān)文獻3,4提??；石杉堿甲（豫中制藥廠生產(chǎn)，批號：H10940156）；A25-35片段，環(huán)磷

10、酸腺苷(cAMP)，青霉素(Penicillin) G，硫酸鏈霉素，MTT（以上試劑由Sigma公司提供）；HAT（次黃嘌呤/胸腺嘧啶核苷/氨甲喋呤，Gibco 公司提供）；胎牛血清（FBS），DMEM培養(yǎng)基（由Hyclone公司提供）。1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司），倒置顯微鏡（南京江南光電股份有限公司），酶標儀（Metertech公司）。1.4 實驗細胞株NG108-15細胞：由廣西中醫(yī)學(xué)院鐘振國教授惠贈。2 方法2.1 含藥血清的制備及實驗血清濃度的選擇 將健康的3月齡Wistar大鼠60只，隨機分為3組，每組20只：正常對照組；石杉堿

11、甲組；二苯乙烯苷組。各組根據(jù)成人治療量換算為大鼠用量，用高劑量灌胃。每天灌胃量0.5ml/100g體重，二苯乙烯苷按0.3g/kg體重，石杉堿甲按0.02mg/kg體重，正常血清組給相應(yīng)體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃10天，于末次給藥后2h，用20%烏拉坦腹腔麻醉，腹主動脈抽血，離心分離血清，56滅活30min，無菌過濾，即得相應(yīng)的含藥血清。將各組含藥血清和正常對照組血清分別加入HAT、雙抗和DMEM培養(yǎng)液，配成含5%、10%、20%的含藥血清和正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液（各組HAT和雙抗的終濃度均為1%），培養(yǎng)NG108-15細胞，以生存率為指標，選擇細胞生長狀態(tài)最好的血清濃度為實驗血

12、清濃度。2.2 A25-35濃度的選擇 將A25-35溶于高壓滅菌后的生理鹽水，配成250mol/L母液備用。在篩選出最佳實驗血清濃度的基礎(chǔ)上，分別比較大鼠血清在A25-35 0mol/L、5mol/L和10mol/L濃度時的細胞生存率，確立A25-35片段在建立細胞模型時的最佳濃度。2.3 AD細胞模型的建立 將NG108-15細胞加入細胞增殖液（5%FBS加DMEM加1%HAT加1%雙抗），在10%CO2、37條件下培養(yǎng)1天，然后加入較適濃度A25-35片段，繼續(xù)培養(yǎng)1天后，即建成AD細胞模型。以各含藥血清或含正常對照組血清DMEM培養(yǎng)液更換原培養(yǎng)液，仍加入上述較適濃度

13、A25-35片段以維持AD細胞模型。培養(yǎng)2天后進行觀察、分析。2.4 細胞存活率觀察  細胞直接置于光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)及計數(shù)其存活率。在培養(yǎng)板每孔上下左右中5個視野各拍片1張，然后在照片上計算培養(yǎng)板各組細胞的數(shù)目，將最初播下的細胞數(shù)定為基數(shù)（100%），然后將各組細胞與原播種細胞數(shù)相比得出各組結(jié)果。2.5 MTT測定法 吸棄待測細胞培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液，加無血清DMEM液100l/孔，MTT液20l，置于37、10%CO2條件下4h，出現(xiàn)藍色結(jié)晶后，加SDS-DMF100l/孔，于37、10%CO2條件下過夜，用酶標儀于=570nm處測OD值。2.6 統(tǒng)計方法  所

14、有檢測結(jié)果以(±s)表示。用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件分析，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，顯著性水平設(shè)在=0.05。3 結(jié)果3.1 不同濃度血清對NG108-15細胞存活率的影響 見表1。5%和10%石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清細胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清（P<0.01或P<0.05）；在20%濃度時組間無差異。同一組內(nèi)不同血清濃度對細胞存活率進行比較，5%明顯高于10%和20%組，但10%和20%濃度組間卻無差別。結(jié)果表明，5%濃度的正常大鼠血清和各含藥血清對維持NG108-15細胞的良好生長狀態(tài)較為合適，故選用5%的血清濃度

15、培養(yǎng)液供實驗用。表1  不同濃度血清對NG108-15細胞存活率的影響（略）注：同一種血清與5%濃度比較，a：P<0.01；同一血清濃度與正常大鼠血清比較，b：P<0.01，c：P<0.053.2  5%濃度血清培養(yǎng)液中不同濃度A25-35對NG108-15細胞存活率的影響見表2。在5%血清濃度下，A25-35 0mol/L及5mol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清細胞存活率明顯高于同濃度的正常大鼠血清（P<0.01）；在10mol/L濃度時組間無差異。同一血清組內(nèi)不同A25-35濃度對細胞存活率進行比較顯示：0mol/L濃度組細胞存活率明顯

16、高于5mol/L和10mol/L濃度組，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在A25-35 5mol/L濃度組細胞存活率比10mol/L濃度組高（P<0.01）。以上結(jié)果表明，二苯乙烯苷含藥血清在無A25-35的毒性作用下，對正常細胞能促進增殖和維持良好的生長態(tài)勢。在A25-35 5mol/L濃度時，二苯乙烯苷和石杉堿甲含藥血清能保護A對NG108-15細胞的毒性殺傷作用，但在A濃度較高（10mol/L）時則未能起到保護作用。表2  5%血清時，不同濃度A25-35對NG108-15細胞存活率的影響（略）注：A25-35濃度相同時與正常大鼠血清比較，a：P<0.01；A25-35

17、濃度不同時同類血清與0mol/L濃度比較，b：P<0.01；A25-35濃度不同時同類血清與5mol/L濃度比較，c：P<0.01。見表3。在5%血清濃度下，A25-35 0mol/L及5mol/L濃度組中石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清組的OD值明顯高于同濃度的正常大鼠血清（P<0.01），但在10mol/L濃度時組間差異無顯著性。同一組血清內(nèi)組間兩兩比較則顯示0mol/L濃度A25-35OD值最高，石杉堿甲和二苯乙烯苷含藥血清在A25-35 5mol/L濃度OD值比10mol/L濃度組高（P<0.01）。以上結(jié)果與細胞計數(shù)法得出的結(jié)果一致。表3  不同濃度A2

18、5-35在NG108-15細胞以不同血清處理2天后的MTT OD值 （略）注：A25-35濃度相同時與正常大鼠血清比較，a：P<0.01；A25-35濃度不同時同類血清與0mol/L濃度比較，b：P<0.01；A25-35濃度不同時同類血清與5mol/L濃度比較，c：P<0.01。4 討論    大量的證據(jù)表明大腦神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑、膽堿能神經(jīng)元的大量缺失是AD的主要病理改變，同時在這些病變的病灶中發(fā)現(xiàn)有大量A沉積物5。一般認為，A或含A順序的淀粉樣蛋白前體（-Amyloid protein precursor, -APP）的降解產(chǎn)物聚集沉積

19、產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用是AD的病因；而神經(jīng)元的死亡、纖維纏結(jié)的形成、血管的損害和癡呆的出現(xiàn)是A沉積的直接結(jié)果68。因此，可把A作為AD腦的生化標記物。A25-35作為全長A的最短有效毒性片段，作用于不同細胞系及實驗動物均顯示出與全長A相近的毒性效應(yīng)，可致培養(yǎng)細胞死亡9,10。故將A25-35片段加入細胞培養(yǎng)液中造模是目前較常用的方法之一。鐘振國等11,12將A25-35產(chǎn)物直接加入到培養(yǎng)中的NG108-15細胞中建立AD細胞模型，其細胞的形態(tài)學(xué)、死亡率、ChAT活性水平、Synapsin水平、Ach遞質(zhì)釋放能力等與AD病理生理變化基本一致，故可用A25-35誘導(dǎo)NG108-15神經(jīng)細胞建立AD細胞模

20、型。    本實驗為探討建立AD細胞模型及藥效考察體系的最佳條件的實驗，結(jié)果表明：過高的二苯乙烯苷含藥血清濃度能降低細胞的存活率，不利于細胞的增殖，同時造成血清的浪費；過低的A25-35濃度達不到造模的目的，過高A25-35濃度又會造成NG108-15細胞的大量死亡，不能靈敏地反映二苯乙烯苷含藥血清的藥效。經(jīng)實驗證實：5mol/L A25-35及5%血清濃度條件時，建立AD細胞模型及藥效考察體系較為合適，在此條件下，應(yīng)用該細胞模型觀察發(fā)現(xiàn)，5%二苯乙烯苷含藥血清能有效地降低A25-35片段對NG108-15神經(jīng)細胞的損害，減少細胞的死亡率。其細胞存活率，與正常大鼠

21、血清組比較差異具有顯著性（P<0.01），而與陽性對照藥石杉堿甲含藥血清組比較則無明顯差異。此細胞模型及藥效考察體系的最佳條件的確立，能靈敏、真實地反映藥效，為進一步考察二苯乙烯苷含藥血清的藥效打下堅實的基礎(chǔ)。    【參考文獻】  1Hartman RE, Laurer H, Longhi L, et al. Apolipoprotein E4 influences amyloid deposition but not cell loss after traumatic brain injury in a mouse model of

22、Alzheimer's disease J. Neurosci,2002,22(23):10083-10087.2Xu TH, Ding J, Shi YL. Toosendanin increases free-Ca2+ concentration in NG108-15 cells via L-type Ca2+ channels J. Acta Pharmacol Sin,2004,25(5):597-601.3朱海升，蔡光明，劉鄂湖，等.大孔吸附樹脂分離純化何首烏有效成分二苯乙烯苷的研究J.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2006，22（4）：269-273.4江濤濤，歐陽臻，繆亞東，等.大孔

23、樹脂吸附純化何首烏中二苯乙烯苷的研究J.中國中藥雜志,2006,31(8):646-649.5Hosoda T, Nakajima H, Honjo H. Estrogen protects neuronal cells from amyloid beta induced apoptotic cell death J. Neuroreport,2001,12(9):1965-1970.6Ding Y, QiaoA, Wang Z, et al. Retinoic acid attenuates -Amyloid deposition and rescues memory deficits in an Alzheimers disease transgenic mouse model J. J Neurosci,2008,28(45):11622-11634.7Oakley H, Cole SL, Logan S, et al. Intraneuronal -amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five Familial Alzheimer's disease mutations: potential factors