兩種Ames試驗(yàn)方法在蒲葵子提取物致突變?cè)囼?yàn)中靈敏度的研究

1、兩種Ames試驗(yàn)方法在蒲葵子提取物致突變?cè)囼?yàn)中靈敏度的研究         【摘要】  目的通過(guò)Ames試驗(yàn)與彷徨試驗(yàn)對(duì)蒲葵子正丁醇提取物的致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果，比較兩種試驗(yàn)的靈敏度。方法對(duì)蒲葵子用正丁醇浸提，用Ames試驗(yàn)方法（摻入法）與彷徨試驗(yàn)方法，對(duì)TA100鼠傷寒沙門(mén)氏菌株進(jìn)行致突變?cè)囼?yàn)。結(jié)果兩種試驗(yàn)方法結(jié)果顯示，蒲葵子正丁醇提取物在5500 g/ml劑量范圍，以Ames試驗(yàn)方法與彷徨試驗(yàn)均檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，而在0.025 g/ml 與0.5 g/ml 劑量下，彷徨試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，而Ames方法未檢

2、測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)論在較低濃度時(shí)，彷徨試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出Ames試驗(yàn)檢測(cè)不出的陽(yáng)性結(jié)果，表明彷徨試驗(yàn)靈敏度較Ames試驗(yàn)高。 【關(guān)鍵詞】  正丁醇提取物；Ames；彷徨試驗(yàn)；靈敏度Abstract：ObjectiveTo compare the sensitivity of  the Fluctuation test and Ames test for examination of  the sudden change caused by Chinese fan-palm sub-normal butyl alcohol extraction.MethodsChinese

3、 fan-palm was extracted with the normal butyl alcohol, and Ames test and Fluctuation test were carried out to detect TA100 mouse salmonella typhimurium.ResultsThe results demonstrated that the extract in the range of 5500 g/ml，the Ames test method and the fluctuation test method detected the positiv

4、e result, and in the range of 0.0250.5 g/ml, the Fluctuation test could examine positive result, but the Ames test could  not change. ConclusionIn low concentration, the Fluctuation test can examine positive result but Ames test can not, which indicated that the Fluctuation test has higher sens

5、itivity than the Ames test.Key words：Normal butyl alcohol extraction;   Ames; Fluctuation test; Sensitivity    鼠傷寒沙門(mén)氏菌哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)（Ames試驗(yàn)），是利用一組組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株加入待測(cè)物在有或沒(méi)有微粒體活化系統(tǒng)條件下，發(fā)生回復(fù)突變的特征鑒定化學(xué)物質(zhì)的誘變活性，現(xiàn)已成為初步篩選化學(xué)物潛在致突變的首選方法。彷徨試驗(yàn)也是一種細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，根據(jù)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株與受試化學(xué)物溫育后在缺乏相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物的培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)情況判斷所試化學(xué)物的誘變活

6、性，節(jié)省試驗(yàn)材料(輔酶其需Ames平板摻入法用量的20%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ames試驗(yàn)結(jié)果與動(dòng)物致突變性有90%的相符率，而彷徨試驗(yàn)對(duì)于弱的、具有細(xì)胞毒性和低濃度的誘變致突變物的檢測(cè)有其優(yōu)超性。因此這些方法是較好的化學(xué)物質(zhì)誘變活性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法。1  材料1 受試藥物蒲葵子正丁醇提取物：蒲葵子分別用95%乙醇回流提取，濃縮成浸膏后，用正丁醇反復(fù)浸提，得到提取物的濃縮部分(以下簡(jiǎn)稱(chēng)蒲葵子提取物)。2 實(shí)驗(yàn)菌株鼠傷寒沙門(mén)氏菌變異株組氨酸缺陷型TA100(由美國(guó)SIGMA公司提供)，經(jīng)鑒定為合格菌株，置于平板備用。3 陽(yáng)性對(duì)照物 2-氨基芴，美國(guó)SIGMA公司；疊氮鈉，美國(guó)SIGMA公司。

7、4 Ames試驗(yàn)培養(yǎng)液按文獻(xiàn)方法1配制，彷徨試驗(yàn)培養(yǎng)液按美國(guó)SIGMA公司提供方法配制，體外活化系統(tǒng)(S9混合液)按標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)大鼠肝微粒體酶制備而成2。2 方法2.1 Ames試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法1，在經(jīng)滅菌的45左右含頂層瓊脂2 ml的試管中，依次加入受試物、菌液各0.1 ml，S9混合液0.5 ml，充分混勻后倒在底層培養(yǎng)基平板上鋪平，37培養(yǎng)48 h，每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性，陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)兩個(gè)平行平皿，每個(gè)受試物至少重復(fù)1次，計(jì)數(shù)平均每毫升回空菌落數(shù)。2.2 彷徨試驗(yàn)（改進(jìn)的Ames試驗(yàn)）3取含組氨酸 (2 gm1)的培養(yǎng)液5 ml加過(guò)夜培養(yǎng)菌液0.1 m1，S9混合液0.

8、1 ml和待測(cè)物0.1 ml，搖勻分裝于50支小試管中，同時(shí)做陰性對(duì)照，37培養(yǎng)20 h，各管加入古溴甲酚紫(5 gm1)的培養(yǎng)液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)變色管數(shù)。         3 結(jié)果3.1 Ames試驗(yàn)凡致突變率(MR=受試物平均回變菌落數(shù)陰性對(duì)照回變菌落數(shù))大于或等于2，有劑量反應(yīng)關(guān)系并有重復(fù)性的受試物為誘變陽(yáng)性4，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)蒲葵子提取物對(duì)TA100(+S9-S9)在5500 g/ml劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出誘變陽(yáng)性。進(jìn)一步分析見(jiàn)表2，可以看出隨著兩種化合物濃度的增加，致突變率均相應(yīng)增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)處理，證明濃度與致突變率間呈直線相關(guān)，表明蒲葵子提取物有一定的誘變活性。表1  蒲葵子提取物Ames試驗(yàn)結(jié)果受試物濃度（略）表2  Ames試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果劑量-反應(yīng)關(guān)系比較（略）3.2 仿徨試驗(yàn)結(jié)果按公式X2=2n（t-c）2 /（t+c）（2n-t-c）(n為50支試管數(shù)，t為實(shí)驗(yàn)組變色管數(shù)，c為對(duì)照組變色管數(shù))，求P值，當(dāng)P0.05時(shí)，判斷為致突變陽(yáng)性。由表3可以看出在Ames試驗(yàn)中蒲葵子提取物在劑量為0.025，0.5 g/ml時(shí)不顯示誘變活性，在彷徨試驗(yàn)中對(duì)TA100在加S9時(shí)表現(xiàn)誘變活性。而且在5500 g/ml時(shí)仍顯示陽(yáng)性結(jié)果。表3  蒲葵子提取物彷徨

10、試驗(yàn)結(jié)果受試物濃度（略）比較兩種試驗(yàn)結(jié)果可知：在Ames試驗(yàn)只有在較高濃度時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。而彷徨試驗(yàn)可以在比其低數(shù)十倍甚至數(shù)百倍濃度時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明彷徨試驗(yàn)的靈敏度高于Ames試驗(yàn)，而且兩者可以相互補(bǔ)充。4 討論   Green等（1976）發(fā)明的彷徨試驗(yàn)（Fluctuation test)是Ames試驗(yàn)的一種改良法。它用液體培養(yǎng)基代替固體培養(yǎng)基，以觀察培養(yǎng)管濁度或pH指示劑顏色的變化代替菌落計(jì)數(shù)，用試管代替培養(yǎng)皿。通過(guò)直觀地對(duì)各試管中液體顏色變化的計(jì)數(shù)，再利用公式對(duì)組間進(jìn)行2檢驗(yàn)，其結(jié)果判定簡(jiǎn)單、直觀、明確、可靠。其檢測(cè)效力已被許多研究者所證實(shí)。1978年Gateho

11、use將其改進(jìn)為彷徨試驗(yàn)方法，通過(guò)文獻(xiàn)了解到該方法與常用的篩選致突變物試驗(yàn)Ames試驗(yàn)（摻入法）比較，有如下的優(yōu)點(diǎn)：有較高的敏感性，可以檢測(cè)出誘變性較弱的致突變物，從而避免因方法靈敏性較差而造成的假陰性結(jié)果。樣品、試劑消耗量少，可同時(shí)進(jìn)行數(shù)個(gè)樣品的檢測(cè)。彷徨試驗(yàn)所用菌株為T(mén)A100，該菌株可用來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變和移碼突變5，該菌株在無(wú)外源性組氨酸供給的情況下不能生長(zhǎng)繁殖，但當(dāng)發(fā)生回復(fù)突變時(shí)則可在無(wú)外源性組氨酸供給的情況下生長(zhǎng)繁殖。由于一些外源性化學(xué)物需經(jīng)體內(nèi)代謝活化才具有誘變活性或經(jīng)代謝而解毒，為了模擬哺乳動(dòng)物對(duì)外源性物質(zhì)的體內(nèi)代謝活化過(guò)程，提高測(cè)試的準(zhǔn)確性，通常在Ames試驗(yàn)中添加哺乳動(dòng)物肝微粒體

12、酶制劑（S9）作為外源性物質(zhì)代謝活化系統(tǒng)6。彷徨試驗(yàn)?zāi)軌蜢`敏、迅速地檢測(cè)到基因的突變情況，是基因突變檢測(cè)的主要方法之一。   據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用Ames試驗(yàn)平扳摻入法嚴(yán)重不足之點(diǎn)是被測(cè)化學(xué)物、S9液、組氨酸加進(jìn)頂層后可能擴(kuò)散到底層去，它們的濃度有隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如要提高測(cè)試物濃度，其毒性可能威脅細(xì)菌的生存 。而彷徨試驗(yàn)克服了這一缺陷，由于其自發(fā)突變率和誘發(fā)突變率均從相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞中顯示出來(lái)，且又為液體誘變，故敏感性高于平皿試驗(yàn)，對(duì)某些陽(yáng)性誘變物的檢出濃度比Ames試驗(yàn)低100倍。本次實(shí)驗(yàn)也證明了彷徨試驗(yàn)的高靈敏特點(diǎn)，因而適于檢測(cè)低水平及很弱的誘變劑。

13、但此法操作費(fèi)時(shí)，一般可作為Ames試驗(yàn)的補(bǔ)充方法。這兩種方法對(duì)人和動(dòng)物的體液監(jiān)測(cè)，環(huán)境致突變因素的研究及流行病學(xué)調(diào)查中潛在致癌物的檢測(cè)具有十分重要的作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1謝恩C·加德編著，范玉明，李毅民，張 舒，等譯.藥物安全性評(píng)價(jià)M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2006：162. 2闞建全,王雅茜,陳宗道，等.甘薯活性多糖抗突變作用的體外實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2001,16(1):23.3彭克軍,劉杰麟.戴氏蟲(chóng)草多糖抗突變活性的研究J.中藥材,2008,31(1):86.4王明臣,張善鋒,毛紅麗,等.Ames實(shí)驗(yàn)對(duì)葉黃素的致突變性與抗突變性研究J.癌變·畸形·突變,2006,18(1):65.5Ordaz-Pichardo C,etal.Antiamoebic and toxicity studies