影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)因素的探討與分析.docxVIP

1、影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)因素的探討與分析宋建國(guó)，周峰(甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州730046)摘要：血凝抑制試驗(yàn)具有所需S5材簡(jiǎn)單、操作方便、試驗(yàn)培果判定快速等優(yōu)點(diǎn)，但該試驗(yàn)影響因素很多，常造成檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。本文從試驗(yàn)器材、試劑、待檢血清、緩沖液、紅細(xì)胞、微量血凝板、環(huán)境溫度及其他影響因素進(jìn)行綜合分析，旨在避免或減少不利因素的影響，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。關(guān)鍵詞：禽流感；新城疫；產(chǎn)下降綜合征；血凝抑制試毀；影響因素中圖分類(lèi)號(hào)：S852.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1001-0769(2015)10-0059-03血凝抑制試驗(yàn)(HI)由于所需器材簡(jiǎn)單、操作方便、試驗(yàn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一

2、種在基層臨床實(shí)踐中極易推廣的檢測(cè)手段與診斷方法。然而，在血凝抑制試驗(yàn)方面，由于受個(gè)人技術(shù)、試驗(yàn)條件、環(huán)境等諸多因素的限制與影響，影響了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確甚至錯(cuò)誤?，F(xiàn)分析如下。1器材的選擇和使用為獲得準(zhǔn)確的檢洌結(jié)果，嚴(yán)格按相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序使用單道、多道移液器，使其始終保持最佳工作狀態(tài)。新購(gòu)移液器在使用前、舊移液器在使用一段時(shí)間后均應(yīng)進(jìn)行校正或鑒定。選購(gòu)正規(guī)廠家生產(chǎn)、質(zhì)量較好的微量反應(yīng)板、吸頭等一次性耗材。1.1單道、多道移液器使用注意事項(xiàng)(1) 吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開(kāi)拇指，不允許突然松開(kāi)，以免因吸液過(guò)快，液體沖入加樣器內(nèi)，使柱塞腐蝕而造成漏氣；(2) 為獲得較高的精確

3、度，在正式加樣前，按緊吸頭后先吸取溶液一次，濕潤(rùn)吸頭，直接吸取因吸頭內(nèi)壁應(yīng)殘留一層"液膜”，造成排液量偏小而產(chǎn)生誤差；1.296孔V型微量反應(yīng)板(1)建議采用96孔110°V型有機(jī)反應(yīng)板進(jìn)行血凝收稿日期：2015-07-06.試驗(yàn)(HA),但注意不要使用底部磨損嚴(yán)重和底部不干凈的反應(yīng)板。采用一次性?xún)?yōu)質(zhì)塑料反應(yīng)板(90°或110°均可)進(jìn)行HI。(2) 使用有機(jī)反應(yīng)板進(jìn)行HI時(shí)，建議按如下程序清洗：試驗(yàn)結(jié)束后，立即用帶有壓力的自來(lái)水反復(fù)沖洗(以看不到孔底有紅血球?yàn)闇?zhǔn))，用力甩干孔內(nèi)剩余的水滴，需要時(shí)反扣在吸水紙上排干。置2%3%濃度的鹽酸浸泡過(guò)夜(12h以

4、上)后，撈出反應(yīng)板并小心將孔內(nèi)殘留鹽酸甩到鹽酸缸內(nèi)，用自來(lái)水沖洗后，用蒸饞水沖洗23次,甩干水分置溫箱中烘干備用。及時(shí)淘汰損壞和底部洗不干凈的反應(yīng)板。(3) 不建議使用鐐子夾棉花或使用試管刷涮洗有機(jī)反應(yīng)板凹孔，以免對(duì)反應(yīng)板板面和孔內(nèi)造成損傷。(4) 建議購(gòu)買(mǎi)材質(zhì)較好的有機(jī)反應(yīng)板，試驗(yàn)前應(yīng)盡可能挑選干凈、內(nèi)孔壁平滑工整的反應(yīng)板，避免因板子質(zhì)量問(wèn)題造成試驗(yàn)結(jié)果的偏離。有機(jī)反應(yīng)板材質(zhì)有好有壞，價(jià)格便宜的反應(yīng)板質(zhì)量差、多內(nèi)孔粗糙、V型底部不工整。因此在采購(gòu)時(shí)，需要進(jìn)行挑選。以減少因反應(yīng)板對(duì)血球凝集和結(jié)果的判定產(chǎn)生影響。2選擇相應(yīng)的檢洲技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)HA與HI試驗(yàn)，雖然原理相同、方法相似，但禽流感、新城疫和產(chǎn)

5、蛋下降綜合征等病各自執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)卻不盡相同，特別是有些關(guān)鍵環(huán)節(jié)存在較大差異。高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T18936-2003)、新城疫診斷技術(shù)(GBJ16550-2008)和產(chǎn)蛋下降綜合征診斷技術(shù)(NY/T551-2002)三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)HA與HI試驗(yàn)中紅血球的離心速度要求存在明顯差異。NY/T551-2002中抗原對(duì)照設(shè)置也不同于前兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，所用稀釋液也非PBS,而是生理鹽水。并且前兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)與SPF雞紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(GBAT17999.2-2008)中的要求也不相同。因此，不同的檢測(cè)項(xiàng)目應(yīng)選用相應(yīng)的檢洌技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)開(kāi)展檢測(cè)，確保試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性和規(guī)范化，是保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和一致性的重要前

6、提。3配液用量具配液時(shí)選擇精準(zhǔn)度高的容量瓶、玻璃吸管和移液器。建議不要使用精準(zhǔn)度低的量筒(特別是大量程量筒和圓錐形量簡(jiǎn)誤差更大)和注射器，量筒一般用于精確度要求不是太高的液體配制(如洗液、消毒液等)，普通注射器的準(zhǔn)確性也不高。4試劑4.1稀釋液4.1.1倍酸鹽試劑不同的檢測(cè)項(xiàng)目，要求使用的稀釋液(磷酸鹽緩沖液PBS)不同。特別是高致病性禽流感和新城疫檢測(cè)所用稀釋液采用的化學(xué)試劑有差異。磷酸鹽必須選用分析純的試劑，稱(chēng)量前應(yīng)注意選用相應(yīng)要求的試劑，結(jié)晶水分子數(shù)不一樣或進(jìn)行結(jié)晶水分子換算。4.12滅菌和pH值調(diào)整配好的PBS須及時(shí)進(jìn)行高壓滅菌或過(guò)濾。而且在高壓滅菌后，需要對(duì)稀釋液的pH值進(jìn)行再次調(diào)整

7、。PBSpH值必須滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)要求。4.1.3稀障液禽流感和新城疫試驗(yàn)使用的稀釋液必須為0.01mol/LpH值7.07.2的PBS,最好不要用生理鹽水，因?yàn)镻BS對(duì)其他酸堿物質(zhì)具有一定的緩沖能力，能維持反應(yīng)體系的pH®,而生理鹽水不具備緩沖功能。試驗(yàn)中使用的PBS在pH值在5.18以下，易造成紅細(xì)胞自凝，pH值在7.3以上時(shí)凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，而pH值為7.07.2時(shí)紅細(xì)胞沉淀最充分，觀察效果最理想。4.1.4抗凝劑選用分析純檸摞酸三鈉配制，濃度為3.8%,配好后進(jìn)行高壓滅菌。4.21%紅細(xì)胞制備(1) 為防止血球發(fā)生自凝，采血時(shí)應(yīng)用預(yù)先吸有3.8%檸檬酸鈉采集至少3只SPF公雞無(wú)禽

8、流感與新城疫等抗體的健康公雞血液，所采血液與抗凝劑按4：15：1的比例混合，采完后應(yīng)及時(shí)把針管小心顛倒幾次，避免出現(xiàn)凝血塊或溶血。(2) 離心洗滌紅細(xì)胞時(shí)，選擇10mL左右的"V"型玻璃離心管進(jìn)行紅細(xì)胞洗滌，建議不要使用5mL或10mL等大小的“U"型塑料離心管洗滌紅細(xì)胞，因"U"型離心管離心時(shí)紅細(xì)胞沉淀不徹底，進(jìn)而影響洗滌效果，最終影響紅細(xì)胞質(zhì)量。(3) 按相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇不同的離心速度進(jìn)行離心。禽流感抗體檢測(cè)1000rpm離心10min,新城疫抗體檢測(cè)2000rpm離心5min10min,產(chǎn)蛋下降綜合征抗體檢測(cè)2000rpm離心5min2次

9、，第3次高心10min,4.3抗原和陽(yáng)性血清(1) 新的未開(kāi)封凍干抗原和陽(yáng)性血清，按抗原瓶身說(shuō)明要求用1mL移液器取相應(yīng)要求量的PBS(產(chǎn)蛋下降綜合征用生理鹽水)進(jìn)行稀釋?zhuān)?2) 已稀釋配制好但暫時(shí)不使用的濃縮抗原、陽(yáng)性血清和均應(yīng)在冰箱4°C保存，有條件的實(shí)驗(yàn)室4HAU抗原可放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上的冰盒內(nèi)。(3) 4HAU抗原需現(xiàn)配現(xiàn)用。為驗(yàn)證洌出的濃縮抗原血凝價(jià)和4HAU抗原配制是否準(zhǔn)確，須做4HAU抗原回歸試驗(yàn)：取0.025mL的PBS加入反應(yīng)板的第26孔；將配制好的4HAU抗原0.025mL分別加入第1和2孔，然后從第2孔依次倍比稀釋至第6孔，最后棄去0.025mL；各孔再加PBS0

10、.025mL,最后加1%紅細(xì)胞懸液0.025mL混勻，室溫靜置30min觀察結(jié)果。若4HAU、2HAU和1HAU能使1%紅細(xì)胞完全凝集，而1/2HAU、1/4HAU和1/8HAU不能完全抑制，說(shuō)明4HAU配制準(zhǔn)確，否則需要重新洌定濃縮抗原的HAU或?qū)?HAU濃度進(jìn)行微調(diào)，直至抗原回歸試驗(yàn)成立。5操作(1)使用微量移液器移液時(shí)慢吸慢放，以保證加樣的準(zhǔn)確性和避免樣品和試劑加在孔壁上或?yàn)R出板孔產(chǎn)生氣溶膠。加樣時(shí)移液器吸頭應(yīng)垂直加入液體，禁止與孔內(nèi)液體接觸。不允許移液器吸頭插入反應(yīng)板孔內(nèi)液面下加液體，防止發(fā)生交叉污染；首次加液時(shí)盡量將所加液體加在V型板的底部，避免加在孔壁上部；(2) 加樣的順序應(yīng)該是

11、由低濃度到商濃度，即先加低濃度孔(第12孔)，后加高濃度孔(第1孔)，以減少樣品加入時(shí)造成交叉污染；(3) 倍比稀釋時(shí)不能速度太快、用力過(guò)猛，避免產(chǎn)生過(guò)多氣泡，使吸頭內(nèi)有大量氣泡，造成移液量誤差，影響反應(yīng)過(guò)程，造成檢測(cè)結(jié)果的偏離；(4) 1%紅細(xì)胞懸液在試驗(yàn)過(guò)程中須隨時(shí)用隨時(shí)搖勻，使之呈均質(zhì)狀態(tài)。(5) 每個(gè)反應(yīng)板盡量都要設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，以驗(yàn)證試驗(yàn)是否成立。6孵育溫度與時(shí)間孵育溫度對(duì)試驗(yàn)的影響較大，溫度既影響HA與HI的滴度，也會(huì)影響反應(yīng)的速度。從4°C37°C,隨看溫度的上升，HA與HI的滴度隨之升高。溫度過(guò)低反應(yīng)速度減慢，溫度過(guò)高會(huì)使反應(yīng)結(jié)果洗脫加快，所以孵育溫度?？刂?/p>

12、在室溫(20°C25°C)。此外，孵育時(shí)間須嚴(yán)格控制在20min40min之間。HI試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間與試驗(yàn)環(huán)境溫度成反比，即環(huán)境溫度越高所需反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短；環(huán)境溫度低于4°C時(shí)紅細(xì)胞可能發(fā)生自凝現(xiàn)象。因此，建議在反應(yīng)20min后，隨時(shí)觀察反應(yīng)結(jié)果，摸索試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)間，以便獲得最準(zhǔn)確結(jié)果，若紐扣狀沉淀較小或發(fā)現(xiàn)淚流狀流淌線細(xì)，可加長(zhǎng)孵育時(shí)間。7結(jié)果的判定(1) HA結(jié)果判定以紅細(xì)胞完全凝集的病毒最大稀釋度為抗原凝集價(jià)。(2) 在陽(yáng)性血清對(duì)照、抗原對(duì)照和1%紅細(xì)胞對(duì)照完全正確情況下，將微量反應(yīng)板傾斜45°左右(不大于60°),孔底沉淀的紅細(xì)胞流動(dòng)性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無(wú)凝集顆粒的為凝集完全抑制，能完全抑制4個(gè)血凝單位抗原的血清最高稀釋度為HI滴度。HI滴度的判定受主觀因素影響較大，判定時(shí)需要與對(duì)照孔進(jìn)行比對(duì)，與其淚滴大小、流速快慢一致的最后孔為其最終值。一般來(lái)說(shuō)，以紅血球?qū)φ胀耆恋淼那昂?min內(nèi)判定試驗(yàn)結(jié)果較好,大約在20min40min左右。8小結(jié)HA和HI試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確與否，試驗(yàn)中的每個(gè)因素都