水痘減毒活疫苗的研究進(jìn)展.docxVIP

1、水痘減毒活疫苗的研究進(jìn)展甘霖I,王明麗'，陳敬賢u1.安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥230032；2.美國酊倫比亞大學(xué)病理與細(xì)胞生物學(xué)教研室，紐約10032摘要:水痘是由水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)引起的種高傳染性疾病。接種疫苗是預(yù)防和控制VZV流行的最有效手段。美國從1995年開始實(shí)施兒童接種水痘疫苗的政策，顯著降低r水痘相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率。近年來，水痘疫苗在我國應(yīng)用越來越廣泛。本文就水痘減毒活疫苗Oka株的研發(fā)，疫苗的有效性、安全性,病毒減毒的分子生物學(xué)特征和免疫策略等方面進(jìn)行綜述，以期能更全面地認(rèn)識水痘減毒疫苗在預(yù)防和控制VZV傳播方面所起的作用。關(guān)鍵詞:水痘帶狀皰疹病毒

2、;Oka疫苗株；水痘疫苗ProgressinvaricellavaccineresearchGANLin1,WANGMing-Li1,JasonChen1,2I.DepartmentofMicrobiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2.DepartmentofPathologyandCellBiology,ColumbiaUniversityNY10032,USAAbstract:Varicellaisahighlycontagiousdiseasecausedbyvaricella-zostervirus(VZV).Vaccina

3、tionhasprovidedthebestmeanstocontrolinfection.Anumberofcountriesmaintainauniversalchildhoodvaccinationpolicysince1995,resultinginadramaticdecreaseintheincidence,morbidityandmortalityrelatedtovaricella.Inthisarticle,wereviewthedevelopmentofvaricellaOkavaccine,theresearchinvaccineefficiencyandsafety,t

4、hemolecularmechanismofattenuation,aswellasnewideasinimmunizationstrategy,summarizingthecurrentadvancesandlimitsofthevaricellavaccinesinceitsworldwideapplication.Keywords:Varicella-zostervirus;Okastrains；Varicellavaccine水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus,VZV)屬皰疹病毒a亞科,為雙鏈DNA病毒，其原發(fā)感染為水痘，潛伏感染再激活時可引發(fā)帶狀皰疹。水痘

5、通常表現(xiàn)為輕癥自限性疾病，伴有特征性皮膚皰疹,偶爾會出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括細(xì)菌繼發(fā)感染、敗血癥性休克、肺炎和腦炎，病死率較高。成人發(fā)生水痘雖然比較少見，但出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥的概率明顯增加。嚴(yán)至的并發(fā)癥在免疫缺陷患者中更常見，免疫缺陷兒童中有50%的水痘患兒會發(fā)生并發(fā)癥。帶狀皰疹是體內(nèi)潛伏的VZV被激活所致，多發(fā)生于成人、老人和免疫缺陷的個體，臨床表現(xiàn)主要是神經(jīng)痛及沿周圍神經(jīng)分布的水皰樣皮疹,隨著年齡增大，帶狀皰疹所致的神經(jīng)痛癥狀越為明顯，持續(xù)時間更長?；痦?xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(30872253)；安徽省科技攻關(guān)計劃(08010302179)通信作者：陳敬賢，E-niail：jc28Columbi

6、a,eduCorrespondingauthor：JasonChen,E-mail:jc28C世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization,WHO)建議水痘疾病相對嚴(yán)重的國家普及疫苗接種。日本和美國分別于1987年、1995年開始推行給易感兒童接種疫苗。迄今VZV減毒疫苗株v-Oka已在日本、美國、韓國、中國和歐洲許多國家相繼被用于預(yù)防水痘。本文就水痘Oka疫苗的研發(fā)，疫苗的安全性、有效性，病毒減毒的可能分子機(jī)制和有關(guān)免疫策略的新思路等進(jìn)行綜述，以期能更全面地認(rèn)識水痘減毒疫苗在預(yù)防和控制VZV傳播方面所起的作用。1水痘疫苗的有效性研究1974年日本學(xué)者Ta

7、kahashi等從1名典型的水痘患兒水皰液中分離得到Oka疫苗株的親本(pOka)，后經(jīng)在豚鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞株(WI-38,MRC-5)多次傳代后,獲得了VZV減毒疫苗株v-Okao疫苗首先在健康的兒童志愿者中進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，疫苗不僅具有良好的安全性和免疫原性，而且有助于防止水痘在易感兒童之間傳播。對接種該疫苗的兒童所進(jìn)行的長期抗體水平檢測顯示，兩年以后98%兒童的血清VZV抗體仍保持陽性,初步說明疫苗具有長期的保護(hù)作用。在臨床早期的有效性研究中，美國采用了隨機(jī)、雙肓、設(shè)置安慰劑對照的方法，在健康兒童中檢測1次接種Oka疫苗（Merck公司）后第1年的有效率,結(jié)果為100%”

8、。隨后芬蘭采用相同的方法進(jìn)行研究'顯示Oka疫苗（GlaxoSmithKline公司）的有效率90%。水痘疫苗上市并廣泛應(yīng)用后，美國曾在加利福尼亞、得克薩斯和賓夕法尼亞3個州監(jiān)測疫苗使用后的水痘發(fā)病情況。數(shù)據(jù)顯示，在此期間這3個州水痘發(fā)病率下降近80%，與水痘相關(guān)的住院率下降88%,水痘引起的病死率下降66%,而且減毒活疫留的使用沒有增加帶狀皰疹的發(fā)病率。澳大利亞從1999年開始使用Oka疫苗，結(jié)果14歲兒童中水痘相關(guān)的住院病例呈逐年下降趨勢5。所有這些資料都顯示水痘疫苗在降低VZV所致疾病的發(fā)病率和病死率方面十分有效。另一項(xiàng)研究為通過檢索19952（X）6年P(guān)ubMed中關(guān)于水痘疫苗

9、有效性的報道來總結(jié)疫苗的免疫效果。研究者根據(jù)報道中水痘患者皮膚皰疹的數(shù)量以及是否存在并發(fā)癥等將病例分為輕微（皮疹50個）、中等（皮疹50-500個）、嚴(yán)重（皮疹500個或存在嚴(yán)重并發(fā)癥）。結(jié)果顯示，水痘疫苗對所有類型水痘的總預(yù)防效果為44%-100%,預(yù)防中等與嚴(yán)重之間水痘的效果為86%100%,預(yù)防嚴(yán)重水痘的效果是100%?？傊鶕?jù)10多年來世界上多個國家的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),v.Oka疫苗的預(yù)防效果是值得充分肯定的。2水痘疫苗減毒機(jī)制的研究NCR:nonccMlingregion；ORFreadingframe(GomiY,etal.,2002.圖1v-Oka與p-Oka基因組之間的核昔酸差異Fi

10、g1.MutationsbetweentheOkavaccinevirus(v-Oka)andtheparentvirus(p-Oka)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開始從分子水平研究v.Oka水痘減毒活疫苗的減毒機(jī)制。首先，通過比較減毒后的v-（）ka與減毒前的親本pOka的全基因序列來了解它們在分子水平上的差別。對病毒基因組的多個部分用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）擴(kuò)增，然后克隆PCR產(chǎn)物或直接對PCR產(chǎn)物測序。比較v-Oka與p-Oka的全基因序列，發(fā)現(xiàn)兩者之間只有42個堿基發(fā)生了改變。DNA序列分析認(rèn)為，其中有20個堿基改變導(dǎo)致了氨基酸發(fā)生轉(zhuǎn)

11、換，有17個是沉默突變，另外5個發(fā)生在非編碼區(qū)。令人驚訝的是，在42個堿基改變的位點(diǎn)中有15個落在開放讀碼框架（openreadingframe,ORE）62中，其中包括8個氨基酸置換，提示ORF62的基因突變可能與p.Oka的減毒有重要關(guān)系。ORF62（以及它的重復(fù)拷貝ORF71）編碼立刻早期蛋白IE62JE62是VZV的主要轉(zhuǎn)錄激活因子，直接參與病毒復(fù)制。除了IE62以外，其他12個氨基酸發(fā)生置換的位點(diǎn)分別位于ORF6、9A、10、21、31、39、50、52、55（1）.55（2）、59和64（圖1）。核酸序列研究發(fā)現(xiàn)，v.Oka是由不同的病毒株組成的混合體。有研究者通過空斑純化方法從V

12、-Oka疫苗獲得13個不同的分離株。對它們的ORF62序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有的株囊括了所有與pOka不同的8個氨基酸(如S70株)，最少的也有5個氨基酸改變(如S7-13株)。為了研究這些不同氨基酸的改變對病毒生物學(xué)性狀的影響，通過比較S7-01、S7.13、v.Oka和p-()ka在人胚肺成纖維細(xì)胞中形成的空斑大小，發(fā)現(xiàn)P-Oka形成的空斑最大，依次為S713、vOka、S7Ql。進(jìn)一步利用感染性中心試驗(yàn)(infectiouscenterassay)來計數(shù)病毒感染的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示pOka感染細(xì)胞的數(shù)量是v-Oka的2.1倍，是S7-13的2.6倍，是S7Q1的4.2倍。以上結(jié)果提示,不同的

13、v-Oka克隆之間在病毒復(fù)制效率方面存在一定差異，p-()ka株的復(fù)制效率高于vOkao因此,IE62中氨基酸的改變可能導(dǎo)致病毒復(fù)制效率以及病毒在細(xì)胞之間的傳播能力下降。對臨床分離的VZV病毒株的ORF62序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)所有的臨床分離株都與P-Oka一樣，在ORF62均有15個堿基位點(diǎn)與v-Oka不同口。因此ORF62的變化很可能是p-Oka發(fā)生減毒作用的主要分子機(jī)制。ORF62中這些單一核昔酸的變化還導(dǎo)致一些酶切位點(diǎn)的改變，如BssH",NaeI和SmaIo分析ORF62中的SgI酶切位點(diǎn)的改變能區(qū)分V.Oka疫苗株與VZV野生型毒株口°。為了更有效地研究v.Oka的

14、減毒機(jī)制，有研究者用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(bacterialartificialchromosome,BAC)克隆(p-Oka的全基因組p-OkaBAC可以在大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)DH10B中穩(wěn)定增殖，從E.coli中提取的DNA轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞后可觀察到典型的細(xì)胞病變，并可傳播給鄰近的細(xì)胞。P-OkaBAC使得研究v-Oka減毒作用的分子機(jī)制變得更為簡便。3水痘疫苗的安全性研究Merck公司制造的v-Oka水痘減毒活疫苗Varivax于1995年被批準(zhǔn)上市，現(xiàn)已應(yīng)用于世界上46個國家。多個國家的學(xué)者對疫苗的免疫效果和安全性做了更多、更全面的研究。Merc

15、k公司本身貝。通過SpontaneousPostmarketingAdverseExperience和VaricellaZosterVirusIdentificationProgram(VZVIP)途徑來獲取疫苗安全性方面的信息。前者是Merck公司從世界各地收集與應(yīng)用有關(guān)Varivax不良反應(yīng)的信息反饋系統(tǒng)，情報資料來自醫(yī)護(hù)人員和疫苗接種者及家屬的主動報告和醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中相關(guān)案例的收集，所收集的不良反應(yīng)主要包括突破感染(breakthrough)和二次傳播(secondarytransmission)等。突破感染是指接種疫苗者在42d后患上水痘(42d以內(nèi)出現(xiàn)皮疹可能由疫苗所致)，說明疫苗在這些

16、個體中沒有起到應(yīng)有的保護(hù)作用。二次傳播是指接種疫苗者發(fā)生感染以后將疫苗病毒傳播給了未接種疫苗的個體，導(dǎo)致后者發(fā)生了由v-Oka疫苗株引起的感染。Merck公司在19952005年的10年間共向全世界銷售了55700000人份的Varivax,一共收到了16683例不良反應(yīng)報告。VZV毒株分型(VZVidentificationprogram,VZVIP)是利用PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶酶切的方法,將水痘病人的VZV區(qū)分為野生型毒株或疫苗株的一項(xiàng)研究課題。臨床標(biāo)本取自下列疫苗接種者:42d內(nèi)出現(xiàn)50個水皰疹、突破感染、帶狀皰疹，伴有并發(fā)癥以及疑似為二次感染的患者，分型工作由紐約哥倫比亞大學(xué)附屬兒童醫(yī)

17、院完成。各類不良反應(yīng)的統(tǒng)計結(jié)果如下:接種疫苗后42d內(nèi)出疹:一共有3192例報告接種疫苗后42d內(nèi)出現(xiàn)皮疹，其中水痘樣皮疹占51%,65%發(fā)生在接種后14d內(nèi)。經(jīng)VZVIP研究發(fā)現(xiàn)，由野生型VZV引起的皮疹發(fā)生較早，疫苗接種后2周內(nèi)出現(xiàn)皮疹的84%是由野生型VZV引起的；而疫苗株引起的出疹發(fā)生較遲,36周出現(xiàn)皮疹的83%是由v-Oka株所致。突破感染：關(guān)于突破感染的報道有5054例，發(fā)生率為0.9/10萬。其中大約1%的患者屬于病情較為嚴(yán)重(皮疹50個)。在所有突破感染的病例中，經(jīng)檢測均未發(fā)現(xiàn)v.Oka疫苗株VZVO帶狀皰疹:接種疫苗后發(fā)生帶狀皰疹的報道共有697例，患者的年齡在13個月和68

18、歲之間，中位數(shù)為3.4歲。用PCR分型技術(shù)對其中的95例進(jìn)行了病毒分型，由v-Oka疫苗株引起的為57例，野生型VZV引起的有38例。進(jìn)一步分析表明，帶狀皰疹出現(xiàn)的位置與疫苗接種的位置高度相關(guān)。神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng):用PCR分析接種疫苗后出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)不良反應(yīng)的30例患者的腦脊液，發(fā)現(xiàn)僅有2例存在VZVDNA,其中1例為野生型VZV,而另1例未能確定基因型。二次傳播:通過VZVIP確認(rèn)的二次傳播有3例,其中1例是30歲孕婦，她的1歲男孩在接種疫苗后的第24天出現(xiàn)約30個皮疹，此后的第16天，母親出現(xiàn)水痘。另1例為4個月男嬰，19d前他不到2歲的哥哥在接種疫苗2周后出現(xiàn)25個皮疹°還有1例

19、為35歲的父親感染了水痘，他的1歲男孩在接種疫苗17d后出現(xiàn)12個皮疹。所有3例病人都與家庭中的疫苗接種者有過密切的接觸。播散性感染:在所有的疫苗接種者中，共有7例播散性的VZV感染被確認(rèn)是由V-Oka引起的，其中6例為免疫缺陷病患者，另1例為唐氏綜合征病人。10年的監(jiān)測研究顯示，v.Oka疫苗(Varivax)的使用顯著降低了水痘相關(guān)的住院率、病死率和醫(yī)療費(fèi)用。大多數(shù)不良反應(yīng)都不嚴(yán)重：2/3的報告病例表現(xiàn)為發(fā)熱、出疹或者注射部位反應(yīng);諸如腦膜炎這樣的嚴(yán)重并發(fā)癥極為少見，旦主要發(fā)生在細(xì)胞免疫損傷的患者中。目前看來,v-()ka疫苗具有普遍的耐受性和良好的安全性，但繼續(xù)監(jiān)測它的安全性是很必要的。

20、4免疫策略的探討最近有研究顯示在接受水痘疫苗免疫接種的兒童中水痘的發(fā)病率有上升趨勢，但是這些突破感染大多未引起嚴(yán)重的臨床癥狀。因此，研究者開始關(guān)注如何更加有效地使用水痘疫苗。哥倫比亞大學(xué)的Gershon教授認(rèn)為，以前檢測血清中VZV抗體含量的方法可能不夠準(zhǔn)確，所檢出的抗體中包括了許多對感染不起保護(hù)作用的抗體，因而對疫苗的免疫效果估計偏高。使用能夠更好地反映保護(hù)性抗體的膜免疫熒光抗體方法(fluorescentantibodytomembraneantigen,FAMA)，檢測一次免疫接種后兒童血清陽性率只有76%,6，因此有必要增加免疫接種的劑量。已有報道顯示增加接種劑量是安全的，并可顯著增強(qiáng)

21、免疫應(yīng)答。以VZV病毒糖蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)檢測VZV抗體，顯示二次接種麻疹-風(fēng)疹-腮腺炎水痘四聯(lián)疫苗比一次接種的陽性率從89%上升到99%，血清中抗體的幾何平均效價從13.0u/ml上升到588u/ml171o而同時其他3種病毒(麻疹風(fēng)疹-腮腺炎)的相應(yīng)抗體效價并未明顯提高，提示VZV病毒與其他病毒不同，一次免疫所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不夠完全。另一項(xiàng)長達(dá)10年以上的研究發(fā)現(xiàn),二次免疫比一次免疫受體發(fā)生突破感染的概率要低。所以初次接種水痘疫苗以后，在適當(dāng)?shù)臅r候再加強(qiáng)免疫1次，將會獲得更好的預(yù)防效果。另外，疫苗的覆蓋

22、率對疫苗的預(yù)防效果也有影響。日本從1987年開始推薦在12個月的易感人群中應(yīng)用水痘疫苗，但是并沒有列入計劃免疫接種的范圍，1987-2005年疫苗接種的覆蓋率只從6.8%增長至32.1%,水痘的流行病學(xué)特征和自然感染率并沒有發(fā)生明顯改變3】。如果能將水痘疫苗列入計劃免疫范圍，將大大增加水痘疫苗的免疫接種覆蓋率。在此基礎(chǔ)上，再實(shí)施加強(qiáng)免疫1次來保持疫苗接受者抵抗野生型VZV感染的能力，將可能逐步減少野生型VZV的感染率，最終消滅野生型vzvo5展望皰疹病毒感染十分普遍，即使痊愈，大多還會伴終身潛伏感染。皰疹病毒相關(guān)疫苗的制備困難較大，進(jìn)展緩慢。VZV減毒活疫苗是迄今第I個也是唯一得到國際上廣泛應(yīng)

23、用的皰疹病毒疫苗。V-Oka株水痘疫苗在預(yù)防水痘方面所起的功效非常顯著。然而，疫苗的使用方法還需要優(yōu)化。目前所遇到的最主要問題包括突破感染常有發(fā)生，有少部分兒童對1個劑量的水痘疫苗不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，以及1次免疫往往不能提供足夠的免疫刺激來產(chǎn)生長效的記憶性T細(xì)胞。因此，不僅要大力推廣水痘疫苗的接種范圍，還需要加強(qiáng)疫苗應(yīng)用后的相關(guān)研究,才能使人們更好地認(rèn)識和使用水痘疫苗，并可能拓展它的使用范圍。參考文獻(xiàn)|1JAsanoY,TakahashiM.Clinicalandserologictestingofalivevaricellavaccineandtwo-yearfollow-upforimmuni

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