仙魚湯對小鼠Lewis肺癌的作用研究

1、仙魚湯對小鼠Lewis肺癌的作用研究        【摘要】    【目的】探討具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中藥復方仙魚湯對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用及其相關(guān)的分子機制。【方法】將50只Lewis肺癌荷瘤小鼠分為仙魚湯高、中、低劑量組(劑量分別為1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1),環(huán)磷酰胺(CTX)組(劑量為20mg·kg-1·d-1),荷瘤模型組;計算各組小鼠平均瘤體質(zhì)量及抑瘤率;制備單細胞懸液,采用流式細胞儀檢測各組小鼠Le

2、wis肺癌細胞周期、細胞凋亡率;采用免疫組化法檢測各組Lewis肺癌小鼠的bcl2基因的表達?！窘Y(jié)果】仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組瘤體質(zhì)量均低于模型組,腫瘤細胞凋亡率均高于模型組(P<0.05或P<0.01),仙魚湯各組隨著藥物劑量的增大,抑瘤率和腫瘤細胞凋亡率逐漸增加。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于S期的細胞比例均低于模型組(P<0.05或P<0.01),呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象。仙魚湯各劑量組bcl2染色強度指數(shù)顯著低于模型組(P<0.01)?！窘Y(jié)論】仙魚湯具有抑制小鼠Lewis肺癌生長的作用,其機理可能與通過降低bcl2表達從而促進腫瘤細胞凋

3、亡有關(guān)。     【關(guān)鍵詞】  仙魚湯/藥理學 肺腫瘤/中藥療法 細胞凋亡 基因表達調(diào)控 細胞培養(yǎng)    肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一,中醫(yī)藥在肺癌的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。仙魚湯是治療肺癌的經(jīng)驗方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的臨床應用已證實其具有較好的臨床療效1-2。本研究通過動物實驗,進一步研究了仙魚湯對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用,并從誘導腫瘤細胞凋亡及調(diào)控凋亡相關(guān)基因的角度探討其作用機理?，F(xiàn)報道如下。    1  材料與方法  &#

4、160; 1.1  動物  C57BL/6J小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量1822g,SPF級,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供(合格證號:0020535)。    1.2  瘤株  小鼠Lewis肺癌細胞株由中國醫(yī)科大學腫瘤研究所提供,廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤研究所長期移植傳代。    1.3  藥物與制備  仙魚湯組成:仙鶴草15g,魚腥草30g,貓爪草30g ,山海螺30g,黨參15g,三七片10g,山慈菇10g,浙貝母15g,守宮5g,天冬15g,黃芪30g,炙甘草

5、5g。由廣州中醫(yī)藥大學新藥研究中心制備,按照傳統(tǒng)煎煮法煎煮,低、中、高劑量組藥物濃度根據(jù)人與動物體表面積與計量換算法計算3,低劑量組1.092g/mL,中劑量組2.184g/mL,高劑量組4.368g/mL,分別相當于臨床等效劑量的1、2、4倍。制備后于4冰箱中貯存?zhèn)溆?。環(huán)磷酰胺(CTX)注射用粉針劑為山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號:20060206),200mg/支,臨用前用生理鹽水溶解,稀釋濃度為2mg/mL,根據(jù)CTX的半數(shù)致死量(LD50)為472mg/kg,注射用量為LD50的1/31/5,故小鼠給藥劑量設(shè)為20mg·kg-1·d-1。  &#

6、160; 1.4  主要試劑與儀器  碘化丙啶(PI)染液為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品;bcl2兔多克隆抗體、即用型過氧化物酶免疫組織化學染色(SABC)試劑盒(SA1022)均為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;二甲苯、乙醇,均為市售分析純;超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司);冷凍桌面離心機(Eppendorf 5810R Centrifuge);解剖顯微鏡(北京電子光學設(shè)備廠);37電熱恒溫水浴箱(上海恒豐儀器儀表有限公司);ALTRA型流式細胞儀(美國Beckman coulter公司);CS型烤片機(孝感市電子儀器廠);億鳴200病理

7、圖像分析系統(tǒng)(中國億鳴)。    1.5  Lewis肺癌荷瘤小鼠模型復制  于液氮罐中取出Lewis肺癌細胞株1支,置于37電熱恒溫水浴箱內(nèi),輕輕搖動令其盡快融化。取出凍存管,用酒精消毒后開啟,用吸管吸出細胞懸液,注入離心管并滴加體積分數(shù)10%小牛血清RPMI16402陽性表達檢測  采用免疫組化法。常規(guī)石蠟包埋后,4m厚連續(xù)切片,行SABC法免疫組織化學染色,用PBS液代替一抗做陰性對照。光學顯微鏡下觀察,bcl2蛋白染色細胞漿呈棕黃色為陽性。在高倍鏡視野(400)下隨機計數(shù)5個視野。計算出各組的染色強度指數(shù)(staining i

8、ntensity index ,pSII)。pSII=(pA強度瘤細胞×0)+(pB強度瘤細胞×1)+(pC強度瘤細胞×2)+(pD強度瘤細胞×3)。其中A強度代表細胞漿無特異性染色;B強度代表細胞漿呈特異性淺棕黃色,染色較淺;C強度代表細胞漿呈特異性棕黃色;D強度代表細胞漿呈特異性深棕色,染色較深。染色強度指數(shù)(pSII)的范圍在03 6。    1.8  統(tǒng)計學分析  采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件處理。    2  結(jié)果    2

9、.1  一般狀況的觀察  實驗結(jié)束后,模型組、CTX組小鼠表現(xiàn)為身體瘦小,活動少,喜聚群,毛發(fā)缺少光澤;CTX組小鼠于實驗57d開始出現(xiàn)脫毛,進食減少;仙魚湯高、中、低劑量組小鼠脫毛現(xiàn)象少于CTX組及模型組,活動力優(yōu)于CTX組及模型組。    2.2  各組抑瘤率比較  表1結(jié)果表明,仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組瘤體質(zhì)量均低于模型組(P<0.05或P<0.01)。各仙魚湯組隨著藥物劑量的增大,瘤體質(zhì)量逐漸減輕,抑瘤率逐漸增高。    表1  各組Lewis肺癌小鼠的瘤體

10、質(zhì)量及抑瘤率比較(略)    Table 1  Comparison of tumor mass weight and tumorinhibitory rate in different groups    統(tǒng)計方法:單因素方差分析;P<0.05,P<0.01,與模型組比較    2.3  各組細胞凋亡率及細胞周期分析  仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組小鼠Lewis肺癌細胞凋亡率均高于模型組(P<0.05或P<0.01),各仙魚湯組隨著劑量的增大,凋

11、亡率亦逐漸增加。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于G0/G1期細胞的比例均高于模型組,其中仙魚湯高劑量組、CTX組與模型組比較,差異有顯著性意義(P<0.01)。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于S期細胞的比例均顯著性低于模型組(P<0.05或P<0.01),呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于G2/M期細胞的比例與模型組比較,差異無顯著性意義(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖1。    2.4  光鏡觀察  模型組癌細胞大小和形態(tài)很不一致,可見瘤巨細胞;癌細胞核體積增大,細胞核和細胞漿

12、比例增大,核的大小、形狀、染色不一,可見巨核、多核,核染色深,核染色質(zhì)呈粗顆粒狀,分布不均勻;核仁肥大,數(shù)目增多,核分裂相增多,可見不對稱性、多極性及頓挫性等病理性核分裂相,間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞少見(圖2-a)。CTX組可見大片壞死,間質(zhì)見較多的淋巴細胞等炎細胞浸潤,纖維組織反應性增生(圖2-b)。仙魚湯各劑量組可見癌巢內(nèi)壞死面積增大,間質(zhì)可見淋巴細胞等炎細胞浸潤,可見較多的細胞凋亡小體(圖2-c、d、e)。    2.5  各組bcl2染色強度指數(shù)  凋亡相關(guān)基因bcl2的陽性產(chǎn)物主要位于細胞漿,可見大量的細胞漿棕黃色顆粒染色。仙魚湯各劑量組bcl

13、22陽性表達比較(免疫組化,×400)(略)    Figure 3  Positive expression of bcl2 in different groups detected by immunohistochemical method    表3  各組bcl2染色強度指數(shù)比較(略)    Table 3  Comparison of staining intensity index of bcl2 in different groups 

14、60;  統(tǒng)計方法:單因素方差分析;P<0.01,與模型組比較    3  討論    多數(shù)學者認為,肺癌發(fā)生發(fā)展的中醫(yī)病機可以用"痰、瘀、虛"3個字高度概括。其中正虛是肺癌發(fā)生的基礎(chǔ),醫(yī)宗必讀云:"積之成者,正氣不足,而后邪氣踞之。"正虛又以脾虛為主,"脾為生痰之源,肺為貯痰之器"。正是脾虛導致痰濁內(nèi)生,進一步血停成瘀,瘀血內(nèi)生,痰瘀內(nèi)阻,蘊積肺部,日久而發(fā)為本病。    廣州中醫(yī)藥大學陳銳深教授從肺癌病因病機出發(fā),以

15、健脾清肺、化痰祛瘀為治療    大法,自擬了治療肺癌的經(jīng)驗方"仙魚湯"。方中君藥為黨參,具有補中益氣、健脾益肺、生津養(yǎng)血的功效,為補益肺脾氣之要藥。黃芪配合黨參,以補肺脾之氣;浙貝母清熱化痰、開郁散結(jié);貓爪草散結(jié)消腫;三七片化瘀散結(jié)止痛,共為臣藥。仙鶴草收斂止血、解毒抗癌;魚腥草清熱解毒、消癰排膿;天冬養(yǎng)陰清肺生津;山海螺解毒消腫、排膿祛痰;山慈菇清熱解毒、化痰消腫散結(jié);守宮散結(jié)止痛,共為佐藥。炙甘草調(diào)和諸藥,為使藥。綜合全方,扶正祛邪,攻補兼施,使祛邪而不傷正,共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。    腫瘤的發(fā)生和發(fā)

16、展不僅與腫瘤細胞的增殖、分化異常有關(guān),而且與細胞凋亡的調(diào)控失常有關(guān)。人類細胞的凋亡機制十分復雜,目前已鑒定出了構(gòu)成凋亡途徑的多種成分,揭示出凋亡是受多種基因調(diào)控的,例如p53、p16、cmyc、bcl2、bax等相關(guān)基因均參與了細胞凋亡的調(diào)控7。bcl2是一種凋亡相關(guān)基因,被激活的bcl2基因的主要作用是抑制細胞凋亡,下調(diào)bcl2基因的表達,對腫瘤細胞有顯著的生長抑制作用。bcl2可能通過阻斷凋亡的公共信號傳遞通路(如抑制線粒體釋放細胞色素C)達到抑制或阻斷多種細胞及細胞系的細胞凋亡過程。隨著該基因蛋白產(chǎn)物的過度表達,使得細胞增殖與凋亡的平衡發(fā)生紊亂,從而阻斷細胞凋亡的最后共同通道,從而抑制細

17、胞凋亡,導致癌變8-11。    本研究通過動物移植性腫瘤實驗法探討仙魚湯對Lewis肺癌生長及腫瘤細胞凋亡的作用。結(jié)果表明,仙魚湯具有一定的抗腫瘤作用,而且其抑瘤作用隨著劑量的增加而增強。從HE染色的病理切片中發(fā)現(xiàn),不同劑量仙魚湯組可見癌巢內(nèi)壞死面積增大,間質(zhì)可見較多的淋巴細胞等炎細胞浸潤,可見較多的細胞凋亡小體。進一步采用流式細胞儀檢測凋亡率,結(jié)果表明仙魚湯具有促進小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的作用,并且隨著劑量的增加作用也逐漸增強。仙魚湯各劑量組處于G0/G1期細胞的比例均高于模型組,處于S期細胞的比例均低于模型組,呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象,提示仙魚湯可

18、能使G1期細胞不能通過細胞周期檢測點進入S期,從而發(fā)生G0/G1期阻滯,阻斷DNA復制,干擾腫瘤細胞周期正常進行,以起到抑制腫瘤的作用。免疫組化檢測結(jié)果顯示,仙魚湯各劑量組bcl2蛋白表達均顯著低于模型組,并隨著仙魚湯劑量的加大,腫瘤組織bcl2的染色強度指數(shù)也逐漸降低。本研究實驗結(jié)果提示仙魚湯可能通過降低bcl2表達的途徑促進腫瘤細胞凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用,對臨床用藥具有一定的指導意義。     【參考文獻】    1李穗暉,陳銳深,吳玉生,等.仙魚湯治療中晚期原發(fā)性支氣管肺癌40例療效觀察J.新中醫(yī),2006,38(9):26.

19、    2王坤,王俊.中醫(yī)藥治療肺癌90例臨床觀察J.黑龍江中醫(yī)藥,1994(2):12.    3馬超英.實驗中醫(yī)學基礎(chǔ)M.北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,2000:279.    4陳奇.中藥藥效研究思路與方法M.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:1001.    5Li Huschtscha W A,Bartuier C E,Anderson R,et al.Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vivoJ.Br J Cancer