吉姆薩染色法對大腦組織凋亡細(xì)胞的染色

1、于4孵育過夜。然后分別用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G及羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司孵育1h。隨機(jī)選取20個(gè)視野于熒光顯微鏡下觀察,免疫熒光染色陽性細(xì)胞為心肌細(xì)胞,計(jì)數(shù)并攝像。同一視野于普通光條件下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù),計(jì)算心肌細(xì)胞純度。2結(jié)果2.1細(xì)胞存活率測定臺(tái)盼藍(lán)染色觀察僅5%細(xì)胞著色,細(xì)胞存活率達(dá)95%以上。2.2心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察剛接種的心肌細(xì)胞尚未貼壁,呈圓形,懸浮于培養(yǎng)液中。812h換培養(yǎng)液時(shí),部分心肌細(xì)胞已貼壁生長,并出現(xiàn)自發(fā)性搏動(dòng),搏動(dòng)頻率較慢,有的每分鐘僅數(shù)次。24h后觀察細(xì)胞已全部貼壁,貼壁后為梭形,菱形或多角形(圖1,90%開始搏動(dòng)。繼而細(xì)胞逐

2、漸在皿底表面鋪展,并伸出偽足,形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網(wǎng),在培養(yǎng)第48h可形成呈放射狀排列的細(xì)胞簇(圖2,其搏動(dòng)已同步化,每分鐘120次左右。培養(yǎng)90d仍可見到成團(tuán)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。2.3心肌細(xì)胞純度鑒定分別用心肌特異性M HC/、Tn I 抗體免疫熒光檢測均證明心肌細(xì)胞純度達(dá)95%以上,并可見明顯的心肌特異性橫紋結(jié)構(gòu)(圖3,圖4。3討論3.1消化過程是影響心肌細(xì)胞存活率的重要因素胰蛋白酶可分解組織間質(zhì)的蛋白成分,但對肌細(xì)胞膜蛋白亦起較強(qiáng)的破壞作用1,故對其作用時(shí)間和濃度的要求較為嚴(yán)格。而每次實(shí)驗(yàn)都可能有細(xì)微差別,所以應(yīng)結(jié)合肉眼觀察消化情況及時(shí)終止消化,不宜固定精確的消化時(shí)間。膠原酶可消

3、化細(xì)胞間質(zhì)的膠原纖維以釋放細(xì)胞1,作用較緩和,對細(xì)胞損傷較小。本實(shí)驗(yàn)室的多年經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為單一使用胰蛋白酶消化對細(xì)胞損傷大,聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時(shí)細(xì)胞沉淀,提高心肌細(xì)胞存活率,細(xì)胞貼壁早,搏動(dòng)出現(xiàn)亦早。第一次消化時(shí)間以35min為宜,主要是去除一些血細(xì)胞、從組織邊緣消化下來的壞死心肌細(xì)胞及其細(xì)胞碎屑,時(shí)間不易太長,否則會(huì)丟棄一些已消化下來的心肌細(xì)胞。終止消化后的消化產(chǎn)物應(yīng)立即離心后重懸于培養(yǎng)液以使受損的細(xì)胞盡早恢復(fù)。消化過程中我們強(qiáng)調(diào)反復(fù)吹打,因?yàn)榇荡蚰苁姑概c組織充分均勻接觸,減少消化次數(shù)和時(shí)間,提高細(xì)胞存活率。每次消化產(chǎn)物并不徹底,需反復(fù)吹打使心肌細(xì)胞呈單個(gè)分散狀態(tài)再終止消化

4、。吹打不充分細(xì)胞團(tuán)塊占5%以上會(huì)大大降低心肌細(xì)胞的收獲率,并且從團(tuán)塊中爬出來的成纖維細(xì)胞影響心肌細(xì)胞的生長和純度。3.2盡可能多的去除成纖維細(xì)胞是提高心肌細(xì)胞純度的關(guān)鍵成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更容易貼壁,采用差速貼壁的方法可去除大部分成纖維細(xì)胞。差速貼壁時(shí)間以1h為最佳,與大部分文獻(xiàn)報(bào)道6090min2,3一致。另外,我們于培養(yǎng)8 12h后換液將培養(yǎng)液中的細(xì)胞團(tuán)塊去掉并加入有絲分裂抑制劑絲裂霉素C(抑制成纖維細(xì)胞的DNA和蛋白合成以盡量減少自細(xì)胞團(tuán)塊中爬出來的成纖維細(xì)胞并抑制其生長,但操作時(shí)需小心謹(jǐn)慎,避免剛剛貼壁的心肌細(xì)胞隨換液而被丟棄。加入溴脫氧尿苷4亦可達(dá)到抑制其增生的目的。3.3培養(yǎng)液是維

5、持細(xì)胞生存的基本條件心肌細(xì)胞在偏酸性環(huán)境中(p H值7.07.2更利于生長,培養(yǎng)液儲(chǔ)存后p H值逐漸升高,最好現(xiàn)配現(xiàn)用。如培養(yǎng)液儲(chǔ)存2周以上還應(yīng)重新加入原量的谷氨酰胺,因?yàn)榧?xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì),而谷氨酰胺在溶液中易分解?？股氐乃幮舛扰c毒效濃度接近,對細(xì)胞可造成損害,實(shí)驗(yàn)中注意無菌操作可有效預(yù)防污染,故培養(yǎng)液中不加抗生素。如經(jīng)費(fèi)條件許可,前48h 可用胎牛血清培養(yǎng),因胎牛血清較新生牛血清含有更多的生長調(diào)節(jié)因子和營養(yǎng)成分,初次分離的心肌細(xì)胞在此環(huán)境中生長更好。圖版說明(圖見插4圖124h后,貼壁的心肌細(xì)胞呈梭形、菱形或多角形,×200.圖248h后,心肌細(xì)胞形成呈放射狀排

6、列的細(xì)胞簇,×200.圖3抗心肌特異性M HC抗體免疫熒光染色,二抗為FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G,×400.圖4抗心肌特異性Tn I抗體免疫熒光染色,二抗為羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G,×400.參考文獻(xiàn)6182636.2Suzuki T,Ohta M,Hoshi H.Serum2free chemically defined medi2 um to evaluate t he direct effect s of growt h factors and inhibitors on proliferation and function of neonata

7、l rat cardiac muscle in culture.In vit ro Cell Dev Biol,1989,25(7:6012606.3Bes S,Roussel P,Laubriet A,et al.Influence of deep hypot herm2 ia on t he tolerance of t he isolated cardiomyocyte to ischemia2reper2 fusion.J Mol Cell Cardiol,2001,33(11:197321988.4Simpson P,Savion S.Differentiation of rat m

8、yocytes in single cell cultures wit h and wit hout proliferating nonmyocardial cells.Circ Res,1982,50(1:1012116.吉姆薩染色法對大腦組織凋亡細(xì)胞的染色徐廣有1張翠香1馮化杰1孟慶輝2(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院,1微形態(tài)實(shí)驗(yàn)室,22000級(jí)檢驗(yàn)系本科生,齊齊哈爾161042根據(jù)資料記載凋亡細(xì)胞的染色可以用吉姆薩染色法1,但具體的操作方法卻未見報(bào)道。我們根據(jù)吉姆薩染料染血涂片的原理,將其用于大鼠大腦海馬區(qū)細(xì)胞的染色,探索出其染色程序,發(fā)現(xiàn)染色效果優(yōu)于常規(guī)H E染色,核仁和凋亡細(xì)胞著263色清晰,細(xì)胞

9、與背景對比明顯?，F(xiàn)介紹如下:1試劑配制2分別量取吉姆薩染料粉劑0.75g、甘油50ml、甲醇50ml。將粉劑放于甘油內(nèi)攪勻,放入60溫箱24h,經(jīng)常搖勻,取出待冷再加甲醇混勻,配成原液,封閉棕色瓶保存。使用時(shí)以原液10ml加入p H為6.46.8的磷酸鹽緩沖液100ml稀釋成工作液。磷酸鹽緩沖液的配制:A液Na2HPO40.946g,蒸餾水100ml;B液KH2PO40.907g,蒸餾水100ml。臨用時(shí)取A 液40ml,B液60ml混合,p H值約為6.64。2染色步驟所用材料為大鼠的大腦。具體操作步驟為:(1常規(guī)脫蠟至水;(2蒸餾水洗;(3在37溫箱中吉姆薩染色30min;(4蒸餾水洗2m

10、in;(5PBS分色適度;(6將切片從PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空氣中略干燥,以肉眼觀察組織上的水分消失為度;(7入100%酒精中30s至1min;(8二甲苯透明5min;(9中性樹膠封片。3結(jié)果背景淡藍(lán)色,核為深藍(lán)色,凋亡細(xì)胞為深藍(lán)色(附圖。4體會(huì)這種染色方法是我們仔細(xì)研究了血涂片的染色方法和經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)總結(jié)出來的。在染色中第6步是關(guān)鍵,我們曾嘗試不經(jīng)過此步驟直接入100%酒精脫水,但脫色嚴(yán)重,無法控制,使染色失敗;我們也曾嘗試在第6步后入95%的酒精中脫水,脫色也非?？?使染色未能成功;最后我們采取將切片從PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空氣中略干燥,以肉眼觀察組織上的水分消

11、失后再入100%酒精脫水,效果良好。因此,用吉姆薩染料染大腦細(xì)胞以其操作簡便、色彩鮮艷、對比度好、細(xì)胞核和凋亡細(xì)胞著色清晰,能夠長期保存、不褪色,為一種值得推廣的方法 。附圖大鼠海馬細(xì)胞參考文獻(xiàn)1 王伯,李玉松, 兩種染色方法對腦垂體三種嗜色細(xì)胞顯示效果的比較柳潔馬曉健(懷化醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,懷化418000腦垂體由腺垂體和神經(jīng)垂體兩部分組成,其中腺垂體內(nèi)有3種類型細(xì)胞:嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞和嫌色細(xì)胞。在常規(guī)的蘇木精伊紅染色切片中,腦垂體3種嗜色細(xì)胞顯示的效果一直不甚理想,學(xué)生在顯微鏡下進(jìn)行觀察辨認(rèn)比較困難,為了更清晰地顯示腦垂體3種嗜色細(xì)胞,我們采用不同的染色方法對腦垂體進(jìn)行染色

12、,經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)顯示,采用Mallory 氏法染色,獲得了較滿意的染色效果,現(xiàn)介紹如下:1材料和方法1.1取材固定取成年雌狗腦垂體,Zenker液固定24h,自來水沖洗12h。1.2脫水、包埋與切片從體積分?jǐn)?shù)為0.5的乙醇梯度上行至無水乙醇進(jìn)行脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5m。1.3脫蠟、脫汞將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,從無水乙醇下行至體積分?jǐn)?shù)為0.7的乙醇,L ngol液脫汞,硫代硫酸鈉、蒸餾水洗。1.4Mallory氏染色切片入0.1%酸性復(fù)紅水溶液染5min。蒸餾水洗,入1%磷鉬酸水溶液媒染5min,蒸餾水洗。切片入混合液(苯胺藍(lán)0.5g,桔黃G2.0g,草酸2.0g,蒸餾水100ml染2min。蒸餾水洗,體積分?jǐn)?shù)為0.95乙醇鑒別,上行至無水乙醇,二甲苯透明,中性樹膠封固1。2結(jié)果嗜酸性細(xì)胞呈圓形或橢圓形,數(shù)量