微生物限度檢驗方法驗證方案

1、第6頁共6頁微生物限度檢驗方法驗證方案1適用范圍本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗方法的驗證。2. 目的通過驗證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測定。3. 職責(zé)項目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗證方案的起草及具體實施。驗證管理員：負(fù)責(zé)驗證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。QA現(xiàn)場監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗證實施過程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗證方案中檢驗方法的審核及按照規(guī)定的取樣計劃對標(biāo)準(zhǔn)檢驗操作程序的準(zhǔn) 確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實施。QC檢驗員：負(fù)責(zé)驗證方案的起草與參與實施，并對所測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗證方案及報告的審核和批準(zhǔn)。4. 內(nèi)容4.1. 概述通過驗證以確認(rèn)所采用的方法適合

2、于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定；確認(rèn)所采用的方 法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方法進(jìn) 行試驗，根據(jù)驗證結(jié)果判斷是否符合驗證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗證的方法和條件進(jìn)行藥品的微 生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進(jìn)行驗證，直至驗證結(jié)果 符合設(shè)立的驗證標(biāo)準(zhǔn)。4.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，以確認(rèn)所采 用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測定。.驗證試驗可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同時進(jìn)行。4.2.1. 驗證用菌株及菌種要求大腸埃希菌【CMCC( B

3、) 44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC( B) 26003】、枯草芽抱桿菌【CMCC (B) 63501】、黑曲霉【CMCC (F) 98003】、白色念珠菌【CMCC (F) 98001】。 大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，枯草芽抱桿菌為產(chǎn)芽抱桿菌， 前述菌株作為細(xì)菌計數(shù)驗證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母 菌計數(shù)驗證用菌株。驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過 5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為 0代)， 并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。4.2.2驗證菌菌液制備4.2.2.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱

4、桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄 球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮培養(yǎng)物至 10ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，3537°C培養(yǎng)1824小時。 取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-610-7,制成 每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。422.2. 白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23 28C培養(yǎng)2448小時；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法， 稀釋至10-610-7，制成每1ml含菌數(shù)50100cfu的菌懸液。4.2.2.3. 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培

5、養(yǎng)基中， 2328C培養(yǎng)57 天,加入 35ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，吸至無菌試管內(nèi)，取 1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液 9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-6,制成每1ml含抱子數(shù)50100cfu的抱子懸液。4.2.3. 供試液的制備4.2.3.1無抑菌活性的供試品供試液的制備稀釋劑：pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1: 10）。 固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1: 10）。4.2.3.2具有抑菌活性的供試品供試

6、液的制備當(dāng)供試品具有抑菌活性時，須先消除抑菌活性，其方法如下：培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取 供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)， 混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長的菌數(shù)之和即為 1ml的菌落數(shù)。計算每1ml 供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌數(shù)；控制菌檢查時可加大增菌液的用量。離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500 轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量

7、。薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶Π被郊姿?，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸 80 （3%）或卵磷 脂（3%）,鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活 性后測定。4.2.4. 菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)。采用平皿法，取試驗用的 1ml菌液（約50100cfu） 分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5試驗組4.2.5.1. 平皿法：取試驗可能用的最低稀

8、釋級 1ml供試液和50100cfu試驗菌，分別注入平皿 中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4252培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗可能用的最低稀釋級1ml供試液分別注入N個平皿中，每個平皿再注入50100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗菌平 行制備2個平皿，按平皿法測定其菌落數(shù)。4.2.5.3薄膜過濾法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次的 沖洗液中加入50100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌落數(shù)。至少要一張膜。4.2.54離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗可能用的最低稀釋級供試液，如供試液含許多藥渣， 先

9、以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml 液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過濾法計數(shù)。4.2.6.供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗組相同）。4.2.7稀釋劑對照組若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾法等處理時，應(yīng)增加稀釋劑對照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗菌，使最終濃度為每1ml供試液含50100cfu，按試驗組的供試液制備方法和計數(shù)方法計數(shù)。4.2.8 .回收率計算4.2.8.1. 試驗組回收率計算試驗組的菌回收率一供試品對照組平均菌落數(shù)試驗組的菌回收率二X 1

10、00%菌液組的平均菌落數(shù)4.2.8.2. 稀釋劑對照組回收率計算稀釋劑對照組平均菌落數(shù)試驗組的菌回收率二X 100%菌液組的平均菌落數(shù)計數(shù)方法驗證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。4.2.8.結(jié)果判斷在3次獨(dú)立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對 照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)70%。照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜

11、過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些 方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗證，使試驗組菌回收率大于70% o43控制菌檢驗方法驗證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗證，以確認(rèn)所采用的方法適合 于該藥品的的控制菌檢查方法測定。若藥品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果 時，檢驗方法應(yīng)進(jìn)行重新驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行。4.3.1.驗證用菌株大腸埃希菌(Esherichia coli)【CMCC(B) 44102】、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus 【CMCC(B)26003】、乙型付傷寒沙門菌 (Salmonella paratyph

12、i B)【CMCC(B) 50094】、銅綠假 單胞菌(Pseudomonas aeruginoSa【CMCC (B) 10104 】驗證實驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。4.32菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基中，3537T培養(yǎng)1824小時；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液，采 用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5107，制成每1ml含菌數(shù)10100cfu的菌懸液。4.3.3. 陰性菌對照組設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證

13、該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗 證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照 菌不得檢出。4.3.4試驗組4.3.4.1常規(guī)法大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照 加入大腸埃希菌10100cfu,陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10100cfu，3537 C培養(yǎng)18 24小時，取此培養(yǎng)物按微生物限度檢查 SOP大腸埃希菌項下規(guī)定檢查。大腸菌群 取含適量(不少于10ml)的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g 或1ml、

14、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌 10100cfu，3537 C培養(yǎng)1824小時，按微 生物限度檢查SOP大腸菌群項下規(guī)定檢查。沙門菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于 200ml）的營養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽性菌對照加入沙門菌10100cfu，陰性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，3537C培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查SOP沙門 菌項下規(guī)定檢查。銅綠假單胞菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性

15、菌對照加入銅綠假單胞菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，3537C培養(yǎng) 1824小時。按微生物限度檢查 SOP沙門菌項下規(guī)定檢查。金黃色葡萄球菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽性菌對照加入金黃色葡萄球菌10100cfu，陰性菌對照加入大腸埃希菌 10100cfu，3537C 培養(yǎng)1824小時。按微生物限度檢查 SOP金黃色葡萄球菌項下規(guī)定檢查。4342培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由 1: 100放大到1: 300、1: 500或1: 1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用

16、不強(qiáng) 的樣品。4.343.薄膜過濾法采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。4.3.4.4. 離心沉淀集菌法取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心35分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗 滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。4.3.4.5. 中和法在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對微生物無毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對微生物亦無毒性，或有毒性但不影響待 檢菌的檢出。4.3.5. 結(jié)果判斷至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗。陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌， 照該供試液制備方法和控制菌