固定化技術(shù)在醫(yī)藥上的研究應(yīng)用

1、固定化技術(shù)在醫(yī)藥上的研究應(yīng)用摘要:綜述了固定化技術(shù)的制作方法及載體的選擇，以及固定化技術(shù)在醫(yī)藥方而的研究與應(yīng)用，并對(duì)固定化技術(shù)的應(yīng)用前景及存在的問題進(jìn)行了評(píng)述。關(guān)鍵詞:固定化技術(shù);定點(diǎn)固定化;無載體固定化;醫(yī)藥 固定化技術(shù)是從60年代開始迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，它是通過采用化學(xué)或物理的手段將游離細(xì)胞或酶定位于限定的空問區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用的一種基本技術(shù)。七十年代后，固定化微生物技術(shù)直接從固定化酶技術(shù)發(fā)展而來，微生物細(xì)胞固定化的方法多種多樣，任何一種限制細(xì)胞自由流動(dòng)的技術(shù)，都可以用來對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行固定化。固定化酶、固定化微生物細(xì)胞、固定化動(dòng)植物細(xì)胞、生物傳感器以及生物反應(yīng)器的研究

2、迅速發(fā)展，形成了一個(gè)范圍廣泛的固定化生物催化劑的研究領(lǐng)域。固定化技術(shù)已廣泛應(yīng)用到食品與發(fā)酵工業(yè)、有機(jī)合成工業(yè)北學(xué)分析、醫(yī)療診斷、環(huán)境凈化及能源生產(chǎn)等各個(gè)領(lǐng)域，充分顯示其美好前景。而固定化在生物技術(shù)方面最主要的應(yīng)用領(lǐng)域是固定化酶，因?yàn)楣潭ɑ敢云涮赜械膬?yōu)點(diǎn)而具有廣闊的發(fā)展前景。它的最大特點(diǎn)是既具有生物催化劑，又具有固相催化劑的特性。與天然酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點(diǎn)：可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)多次使用，而且在大多數(shù)情況下，酶的 穩(wěn)定性提高。如固定化的葡萄糖異構(gòu)酶，可以在6065。C條件下來連續(xù)使用超過1000h。固定化黃色短桿菌中的延胡索酸酶用于生產(chǎn)L-蘋果酸，連續(xù)反應(yīng)一年，其活力仍保持不變。反應(yīng)后，酶與

3、底物和產(chǎn)物易于分開，產(chǎn)物中無殘留酶，易于純化，產(chǎn)品質(zhì)量高。反應(yīng)條件易于控制，可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)控制。酶的利用效率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量減少。比水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)。 1固定化方法1 1載體選擇 固定化技術(shù)中使用的載體需符合如下條件:固定化過程中不引起活性喪失;對(duì)酸、堿有一定的耐受性;有一定的機(jī)械強(qiáng)度;有一定的親水性及良好的穩(wěn)定性;有一定的疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒均勻;共價(jià)結(jié)合時(shí)具有可活性基團(tuán);廉價(jià)易得等。目前用于結(jié)合法的載體主要有:碎石、卵石、煤渣、焦碳、硅藻土、多孔磚、石英砂、硅膠、沸石及活性炭等，它們可分別應(yīng)用于不同的處理工藝。用于包埋法的材料有聚乙烯醇(PVA) ,聚

4、丙烯酞氨( ACAM) ,聚乙烯乙二醇( PEG ) ,瓊脂、海藻酸鈣、角義菜膠和聚丙稀酸等。值得注意的是，通常載體都要經(jīng)過活化后才能用于固定化技術(shù)，例如對(duì)于纖維素載體通常要引入脂肪族或芳香族氨基、梭基或硫羥基來活化羥基。1 2固定化方法的選擇固定化方法中研究最多的是酶固定化方法，酶的固定化方法可增加酶的穩(wěn)定性。目前主要的固定化方法有:1 2.1載體結(jié)合法 載體結(jié)合法是結(jié)合于不溶性載體上的一種固定化方法，根據(jù)結(jié)合形式的不同，可分為物理吸附法、離了結(jié)合法和共價(jià)結(jié)合法3種。1 2.2交聯(lián)法 交聯(lián)法是用雙功能基團(tuán)或雙功能試劑，使酶與酶或細(xì)胞與細(xì)胞之問交聯(lián)的固定化方法。這一固定化方法附著牢固，不易漏失

5、，但由于固定化過程中涉及化學(xué)反應(yīng)，因而失活現(xiàn)象較為嚴(yán)重。1 2.3包埋法 包埋法是將酶或細(xì)胞包埋于聚合物中的一種固定化方法，主要有以下兒種類型:網(wǎng)格型、微囊型和脂質(zhì)型。包埋法制備方法簡(jiǎn)單，條件溫和，一般不涉及酶分了的化學(xué)變化，因而酶活力回收率高，但是酶容易漏失，催化反應(yīng)受傳質(zhì)阻力的限制，不易催化大分了底物的反應(yīng)。1 2.4選擇性熱變性法 選擇性熱變性法是將細(xì)胞在適當(dāng)溫度下處理使細(xì)胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。1 2.5定點(diǎn)固定化技術(shù) 定點(diǎn)固定化技術(shù)是借助分了生物學(xué)方法，通過酶蛋白上的特定位點(diǎn)與膜載體作用，在膜表面形成一種高度有序的酶分了的二維陣列。酶蛋白上的作用位點(diǎn)遠(yuǎn)離催

6、化活性中心，使底物能充分接近活性中心。定點(diǎn)固定化方法主要有3種:抗體偶聯(lián)法、生物素親和素親和法和氨基酸置換法。與隨機(jī)固定化方法相比，定點(diǎn)固定化技術(shù)的活力和固定量都有顯著提高。1 2.6無載體固定化技術(shù)無載體固定化技術(shù)取得的重大突破是交聯(lián)酶結(jié)晶( CLECs)技術(shù)1，CLECs是一種無需載體、既有純蛋白的高度特異活性又對(duì)有機(jī)溶劑具有高度耐受性的生物催化劑。2000年荷蘭Delft大學(xué)的Sheldon小組提出一種用鹽、有機(jī)溶劑或非離了聚合物等沉淀劑沉淀酶蛋白，得到酶聚集體，再用戊二醛交聯(lián)的無載體固定化方法交聯(lián)酶聚集體(C LEA s)技術(shù)2。C LEA s技術(shù)是繼CLECs之后的又一種無載體固定化

7、技術(shù)。近兒年，交聯(lián)酶聚集體技術(shù)已被成功地應(yīng)用于青霉素酞化酶、脈酶、氧化還原酶和7種不同微生物來源的脂肪酶的固定化。1 2.7聯(lián)合固定化技術(shù) 聯(lián)合固定化技術(shù)最初是把外來酶結(jié)合于固定化完整細(xì)胞上，后來人們又發(fā)展到將兩種酶、兩種微生物細(xì)胞以及生物催化劑(酶細(xì)胞)與底物或其他物質(zhì)聯(lián)合固定在一起。聯(lián)合固定化技術(shù)是酶、細(xì)胞固定化技術(shù)發(fā)展的綜合產(chǎn)物，與普通固定化技術(shù)相比，可以充分利用酶和細(xì)胞的各自特點(diǎn)，把不同來源的酶和細(xì)胞的生物催化性質(zhì)結(jié)合到一起。多種酶同時(shí)固定在膜材料上，利用各自的功能協(xié)同催化復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程是固定化研究的一個(gè)新方向，此外，酶還可以與細(xì)胞及其它一些生物分了共固定，構(gòu)成更為復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化體

8、系。1 2.8藕合固定化技術(shù)6 藕合固定化是指兒種固定化方法或載體的聯(lián)合使用，即添加穩(wěn)定因了和促進(jìn)因了的固定化方法。藕合固定化基本上能夠解決單一固定化方法酶活回收率低、穩(wěn)定性差轉(zhuǎn)質(zhì)阻力差等問題，并具有方法多樣、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)成熟等特點(diǎn)。隨著人們對(duì)固定化酶微環(huán)境認(rèn)識(shí)和研究的進(jìn)一步加深，藕合固定化技術(shù)3將逐步成為研究的熱點(diǎn)。Culla KC4等在酶的固定化過程中添加了一些抗生素和鹽，它們能和二硫鍵還原產(chǎn)生的硫醇(如B-巰基乙醇,N-乙酰馬來酰亞胺)相互作用，降低硫醇含量達(dá)到穩(wěn)定酶活力的目的。 2固定化技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用2 1 抗生素上應(yīng)用 自20世紀(jì)70年代初，歐美國(guó)家已開始用特殊的合成樹脂固定

9、化青霉素酞化酶來生產(chǎn)6 -APA5，但價(jià)格昂貴，酶活還較低。中國(guó)關(guān)于固定化青霉素酞化酶的研究工作起步較晚，還要靠進(jìn)口價(jià)格昂貴的固定化載體或固定化青霉素酞化酶來滿足半合成青霉素生產(chǎn)的需要。2 1.1 用于生產(chǎn)內(nèi)酞胺類抗生素中問體青霉素酞化酶在偏堿性環(huán)境下，可以催化青霉素G和頭抱菌素G水解，制備生產(chǎn)半合成p內(nèi)酞胺類抗生素所需的中問體:6-氨基青霉烷酸(6 -A PA)和7氨基脫乙酞頭抱烷酸7(7 -ADCA )。傳統(tǒng)上多采用氧化反應(yīng)酒旨化及擴(kuò)環(huán)重排等化學(xué)反應(yīng)來合成7- ADCA，但其過程存在著步驟多、反應(yīng)條件要求高、成本高、三廢污染等問題，現(xiàn)在已逐漸被固定化方法所替代。2 1.2 用于生產(chǎn)半合成內(nèi)

10、酞胺類抗生素固定化青霉素酞化酶在酸性環(huán)境中可催化6APA,7AD-以發(fā)生酞基化反應(yīng)制備半合成抗生素，該方法具有穩(wěn)定性好、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品純度高、污染少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，受到人們的重視。2 2 氨基酸上應(yīng)用 氨基酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本單位，對(duì)維持機(jī)體蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡有極其重要的意義。自然界的天然蛋白質(zhì)中存在20余種基本氨基酸，皆為L(zhǎng)型，非基本氨基酸多為外消旋體，然而D型和L型對(duì)映體的生理作用迥異。氨基酸主要通過發(fā)酵法和合成法生產(chǎn)，D-氨基酸一般通過光學(xué)拆分得到。D-氨基?；咐闷淞Ⅲw專一性反應(yīng)，從化學(xué)合成的底物生產(chǎn)具有光學(xué)活性的D -氨基酸 蒲廣西等研究了利用基因重組工程技術(shù)構(gòu)建高活性的氨基酞化酶工

11、程菌連續(xù)拆分D, L蛋氨酸9。氨基酞化酶工程菌經(jīng)發(fā)酵收集高活性的菌體，通過海藻酸鈉包埋技術(shù)制備固定化酶，連續(xù)拆分D,L蛋氨酸，結(jié)果比酶活性大于6 000 u/g濕菌體，酶柱比酶活性大于4 000 u/g酶，半衰期20d,可連續(xù)拆分24d,拆分率達(dá)90%，收率達(dá)74.5%左右。隨著基因工程藥物和固定化技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)D氨基酸的需求日益增加，因此篩選具有高活力D氨基?；傅木辏⑶医⑵鸷?jiǎn)單快捷生產(chǎn)D氨基酸的方法有著廣闊的工業(yè)前景。2 3 酶制劑上應(yīng)用 脂肪酶不僅能夠催化酷的水解反應(yīng)，而且能在有機(jī)溶劑中催化醇和酸的酷合成反應(yīng)酒旨交換反應(yīng)、氨解反應(yīng)馱合成反應(yīng)等等。陳秀琳研究以cM-纖維素10為載

12、體固定化脂肪酶的最適制備條件，固定化酶的酶學(xué)特性以及操作的穩(wěn)定性，結(jié)果表明本法制備得到的固定化酶酶活力較高，回收率也較高，最適溫度，pH都有了提高，穩(wěn)定性也提高了，酶和載體問的結(jié)合力較牢固。目前脂肪酶制造油化學(xué)品的重要障礙就是脂肪酶價(jià)格較高，而固定化酶具有可以回收、重復(fù)使用、穩(wěn)定性高產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)，所以脂肪酶的固定化技術(shù)可以在藥物制備、食品及輕工等方面廣泛應(yīng)用。 固定化胰蛋白酶11( imm ob ilized trypsin,IFP )是人胰島素固相酶促半合成轉(zhuǎn)化反應(yīng)中的催化劑，高秀蓉等對(duì)其催化特性和穩(wěn)定性與固定化之前相比進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶經(jīng)固定化后，最適作用PH值范圍變窄，最適作用

13、溫度和Km值升高，熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性均有所增強(qiáng)。2 4藥物篩選上應(yīng)用 藥物篩選就是對(duì)可能作為藥物的物質(zhì)進(jìn)行初步的藥理活性的檢測(cè)和試驗(yàn)，以求發(fā)現(xiàn)其藥用價(jià)值和臨床用途，為發(fā)展新藥提供最初始的依據(jù)和資料。傳統(tǒng)的藥物篩選方法是采用藥理學(xué)的方法，通過體內(nèi)、體外多種試驗(yàn)，評(píng)價(jià)藥用樣品的藥學(xué)活性。直到20世紀(jì)70年代中期，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一直是藥物篩選的主要方法，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在需時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、操作技術(shù)要求高、受試樣品需要量大等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代科技的發(fā)展為高效率的篩選藥物提供了技術(shù)條件，高通量藥物篩選技術(shù)12(HTS)就是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的一種新的技術(shù)體系。 在高通量篩選中，鄰位閃爍分析13(Scinti

14、llation-Prox in ityA ssay)由于具有檢測(cè)靈敏度高，分析適用性寬和無須對(duì)反應(yīng)物及底物進(jìn)行繁瑣的分離等優(yōu)點(diǎn)已發(fā)展為高通量篩選實(shí)驗(yàn)室最常見、最基本的分析檢測(cè)手段之一?；驹硎菍蟹至?受體、酶或相關(guān)大分了)固定于含有熒光閃爍劑的微球表面，當(dāng)發(fā)生標(biāo)記的配基與受體親合時(shí)，標(biāo)記的同位素釋放的粒了就會(huì)激活微球中的閃爍劑產(chǎn)生熒光;反之無親合作用時(shí)，放射性同位素距離閃爍劑較遠(yuǎn)，無法激活閃爍劑，故不產(chǎn)生熒光。從鄰位技術(shù)的基本過程看，藥物篩選涉及靶分了固定化和配靶親合等亞過程，藥物的療效取決于分了自身的結(jié)構(gòu)及靶分了的構(gòu)像，固定化能對(duì)靶分了構(gòu)像造成一定的影響，固定化過程中可能存在的靶分了與靶

15、分了、靶分了與微球、體相與表面相之問存在的相互作用，因此鄰位篩選的效果依賴固定化方法。 用于藥物篩選的膜蛋白微陣列，由于類脂環(huán)境影響膜蛋白的功能難以很好發(fā)揮，使微陣列制作有困難。最近微陣列技術(shù)取得了突破性進(jìn)展，解決了膜和蛋白的固定化問題，發(fā)明了一種機(jī)械上穩(wěn)定又允許單個(gè)分了在固定化膜內(nèi)移動(dòng)的系統(tǒng)，這種水平方向流動(dòng)性是生物膜的特性之一。 隨著國(guó)際藥物研究形勢(shì)的發(fā)展，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥已迫在眉睫，我國(guó)天然資源豐富，應(yīng)用高效的藥物篩選方法，利于從海洋生物、中藥材植物資源中開發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新藥。2 5 手性藥物上應(yīng)用 手性藥物的臨床意義已引起了人們的注意，并成為國(guó)際開發(fā)熱點(diǎn)，世界正在開發(fā)

16、的1 200種新藥種有三分之一是手性藥物，同時(shí)手性藥物又是藥品開發(fā)中的難點(diǎn)，往往是一種對(duì)映體具有很大的藥用價(jià)值，而另一對(duì)映體沒有藥效，甚至對(duì)人體有毒害作用。如何從對(duì)映異構(gòu)體中分離出有效成分或合成有效成分是目前面臨的一大課題。青霉素?；?2對(duì)L型氨基酸具有極高的選擇性，在固定化青霉素酰化酶作用下，很容易使L-苯甘氨酸和D-苯甘氨酰胺合成D-甘氨酰胺-L甘氨酸，其可進(jìn)一步環(huán)化為具有立體構(gòu)象的D, L-3,6-苯哌嗪-2, 5-二酮。3，6-二苯哌嗪-2，5-二酮的這兩個(gè)異構(gòu)體具有較多的應(yīng)用價(jià)值，不但可用作食品添加劑、殼聚糖酶抑制劑13，還可用作抗病原體和抗過敏藥物，D-甘氨酰胺-L-苯甘氨酸本身

17、就是一種低毒性的腫瘤和組織消溶劑14。所以固定化技術(shù)適合于手性藥物的工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。 手性藥物相互作用的研究也應(yīng)用了固定化的方法。如應(yīng)用親合色譜技術(shù)時(shí)，可以在色譜柱上固定化HAS15或AGP16來研究手性藥物發(fā)生在分布環(huán)節(jié)的相互作用，就是在流動(dòng)相中添加并用藥物來考察并用藥物與對(duì)映體在分布環(huán)節(jié)有無相互作用。2 6 中草藥上應(yīng)用 于榮敏等以聚胺酯泡沫為固定化材料，對(duì)固定化銀杏細(xì)胞培養(yǎng)法17生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯進(jìn)行研究。通過用高密度、小孔徑聚胺酷材料P29,將其切成0 5 cmx 0 .5 cm x0. 5 cm的小塊，每瓶加0 72 g載體，加65 m L液體培養(yǎng)基，接種鮮重200 g /I,考察各種因素

18、對(duì)固定化銀杏細(xì)胞培養(yǎng)的影響，結(jié)果可得到高達(dá)71%的固定化比例，載體上細(xì)胞密度達(dá)到干重22mg/cm3。由此可見以聚胺酷泡沫為固定化材料進(jìn)行銀杏細(xì)胞固定化培養(yǎng)具有方法簡(jiǎn)便、成本低廉、細(xì)胞固定化比例高等優(yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。3 展望 最近光、輻射等物理技術(shù)應(yīng)用于酶固定化，大大促進(jìn)了這一領(lǐng)域的發(fā)展。光引發(fā)聚合常被用于制備固定化酶的膜或?qū)δげ牧线M(jìn)行改性;輻射技術(shù)在固定化酶領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，能有效提高酶的活力，也用于膜材料的制備和改性;等離子體技術(shù)處理膜材料，產(chǎn)生各種能量粒了與載體表面作用，在表面引入羥基、氨基、羧基、羰基等基團(tuán)，達(dá)到改變載體表面化學(xué)結(jié)構(gòu)的目的，繼而進(jìn)行酶的固定化。自1953年酶固定化

19、方法首次提出以來，人們不斷探索新的固定化方法，以期提高酶在各方面的穩(wěn)定性。從吸附、包埋、共價(jià)偶聯(lián)到交聯(lián)法，從載體固定到無載體固定，固定化技術(shù)不斷發(fā)展。目前尋找更好的固定化材料和固定化方法仍是各國(guó)科研人員正在進(jìn)行的課題，固定化后回收率高、多批次使用損失小掖固分離良好是我們需要考慮的指標(biāo)。參考文獻(xiàn):【1】DSouza SF. Imm ob ilization and for stabilization of biom ateri s for applicationsJ.Appl Biochen Biotechnol, 2001, 96( 1一3): 225一238【2】武仙山，何立千，葉磊. 交聯(lián)

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