藥代動力學(xué)實驗

1、藥物代謝動力學(xué)實驗藥物代謝動力學(xué)實驗2012年年10月月16日日編輯ppt神農(nóng)嘗百草神農(nóng)嘗百草 傳說神農(nóng)一生下來就是個“水晶肚”，幾乎是全透明的，五臟六腑全都能看得見，還能看得見吃進(jìn)去的東西。那時候，人們經(jīng)常因亂吃東西而生病，甚至喪命。神農(nóng)為此決心嘗遍百草，能吃的放在身體左邊的袋子里，介紹給別人吃；不好吃的就放在身體右邊袋子里，作藥用。不能吃的就提醒人們注意。編輯ppt3藥物代謝動力學(xué)藥物代謝動力學(xué)定量研究藥物（包括外來化學(xué)物質(zhì)）在生物體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝（簡定量研究藥物（包括外來化學(xué)物質(zhì)）在生物體內(nèi)吸收、分布、排泄和代謝（簡稱體內(nèi)過程）規(guī)律的一門學(xué)科。稱體內(nèi)過程）規(guī)律的一門學(xué)科。常用測

2、常用測定方法定方法 HPLC-UV ?GC-MS ? LC-MS/MS ?編輯ppt 1.HPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP) 2.實驗設(shè)計與動物實驗 3.樣品處理與方法開發(fā) 4.定性定量與分析測定 5.數(shù)據(jù)處理與藥動學(xué)參數(shù)計算 6.實驗報告實驗安排實驗安排靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究靜注加替沙星在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究編輯pptHPLC原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程原理與標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)1.HPLC的組成2.分配色譜的原理3.色譜柱4.流動相5.定性與定量方法6.樣品的預(yù)處理7.反相色譜分析方法的開發(fā)編輯ppt High Performance Liquid Chromatograph

3、y HPLC 的組成 Pump 泵 Injector/Autosampler 進(jìn)樣器/自動進(jìn)樣器 Column 色譜柱 Detector 檢測器 Data System/Integrator 數(shù)據(jù)系統(tǒng)/積分儀表編輯ppt高效液相色譜系統(tǒng)色譜泵進(jìn)樣器檢測器數(shù)據(jù)處理色譜柱編輯ppt高效液相色譜系統(tǒng)SHIMADZU LCMS-2010EVLC-MS/MS Thermo TSQ Quantum Access編輯ppt分配色譜的分離機(jī)理編輯ppt分配色譜概述 反相色譜的主要類型，基于分子的極性分離 洗脫次序：一般為反相，即極性高的先被洗脫 常用的流動相： 有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，水 應(yīng)用添加劑，成為離子對

4、、離子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基團(tuán) 反相色譜固定相多為鍵合相編輯ppt對HPLC柱的了解 色譜柱分類 填料，含碳量，基質(zhì)，粒徑 色譜柱的應(yīng)用 正相柱，反相柱，預(yù)處理柱 色譜柱的規(guī)格 島津 Shimadzu VP-ODS; 150L2.0; 5m; 柱號 8082693.編輯ppt鍵合相色譜柱 以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。 優(yōu)點 固定相穩(wěn)定，不易流失 應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑 消除硅羥基的不良影響 缺點 pH值不能小于3 同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同編輯ppt反相C18色譜柱的活化 步驟一：步驟一： 90%甲醇1mL/m

5、in流速沖洗30min 步驟二：步驟二： 10%甲醇1mL/min流速沖洗30min 步驟三：步驟三： 90%甲醇1mL/min流速沖洗60min編輯ppt色譜柱的存放 存放前的處理 除去雜質(zhì)、鹽 合適的存放溶劑 避免色譜柱床的干枯 避免機(jī)械震動 防止細(xì)菌生長 注意存放的溫度編輯ppt液相色譜對流動相的要求 除色譜柱對流動相對的要求外，還有 與檢測器匹配 脫氣脫氣 避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)） 溶劑的粘度 細(xì)菌的生長編輯ppt流動相的脫氣 流動相脫氣的目的 使色譜泵的輸液準(zhǔn)確 輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小 保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高 提高檢測的性能 防止氣泡引起的尖峰 基線穩(wěn)定，信噪比增加

6、溶劑的紫外吸收本底降低 保護(hù)色譜柱 減少死體積 防止填料的氧化編輯ppt流動相脫氣的方法 加熱 簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化 抽真空抽真空 同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果 超聲波超聲波 簡單，但效果不理想。 通惰性氣體（一般用氦氣） 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度 脫氣機(jī) 可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度編輯ppt色譜峰定性 鑒別每個色譜峰 通過比較保留值(通常是保留時間保留時間)的方法，找到各色譜峰所對應(yīng)的組份 大多數(shù)情況下用比較保留時間來定性即所謂：保留時間相同，可能是同樣的組份保留時間不同，肯定不是同樣的組份編輯ppt用保留時間定性 用“標(biāo)樣

7、”的保留值定出被測組份的位置0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben編輯ppt標(biāo)準(zhǔn)加入法舉例 廢水樣品中五氯苯（PCP）的分析PCP4 ppm3 ppm2 ppm1 ppm編輯ppt常用的定量方法 峰面積百分比法峰面積百分比法 由于檢測技術(shù)的影響，在液相色譜中不常用 外標(biāo)法外標(biāo)法 在液相色譜中用的最多 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 準(zhǔn)確，但是麻煩 在標(biāo)準(zhǔn)方法中用的最多編輯ppt外標(biāo)

8、法定量 配制一系列已知濃度的標(biāo)樣編輯ppt外標(biāo)法定量（二） 實際色譜圖0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06

9、.5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000樣品濃度響應(yīng)值峰面積()標(biāo)準(zhǔn)曲線編輯ppt內(nèi)標(biāo)法定量（一） 配制一系列濃度的標(biāo)樣，其中加有內(nèi)標(biāo)樣編輯ppt內(nèi)標(biāo)法定量（二） 實際色譜圖0.000.200.400.600.801.001.20

10、1.401.601.802.002.503.003.504.004.505.005.506.00voltsMinutesM ethylParabenEthylParabenPropylParabenButylParaben05010015020025001020304050樣品濃度標(biāo)樣峰面積內(nèi)標(biāo)樣峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線編輯ppt內(nèi)標(biāo)法定量（三） 對內(nèi)標(biāo)物的要求對內(nèi)標(biāo)物的要求 化學(xué)結(jié)構(gòu)與待測組分相似(同系物、異構(gòu)體) 在樣品中不存在 不與樣品中組份發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng) 保留值與待測組分接近 濃度（響應(yīng)值）與待測組分相當(dāng) 其色譜峰與其他色譜峰分離好編輯ppt可接收的檢測范圍 校正曲線只有在建立這條曲線的濃度范

11、圍內(nèi)有效，高或低于這些點都可能引起計算錯誤最低濃度標(biāo)樣最高濃度標(biāo)樣所希望的檢測范圍線性問題靈敏度問題檢測器響應(yīng)樣品濃度編輯ppt樣品的預(yù)處理 樣品預(yù)處理的目的 除去微粒 減少干擾雜質(zhì) 濃縮微量的組份 提高檢測的靈敏度及選擇性 改善分離的效果 有利于色譜柱及儀器的保護(hù)編輯ppt樣品的預(yù)處理重要性 占樣品分析時間的比例 樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)大于色譜分離的時間 占分析的消耗總成本最大 消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品 實驗的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié) 影響實驗結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟是決定性的步驟編輯ppt樣品預(yù)處理常用的方法 高速離心 過濾、超濾 選擇性沉淀選擇性沉淀 衍生反應(yīng) 液液-固萃取固

12、萃取 / 液液-液萃取液萃取 Sep-Pak樣品處理小柱 其他編輯ppt選擇性沉淀 常用于生化樣品中除蛋白 有機(jī)溶劑 乙腈，甲醇 強酸 三氯乙酸，過氯酸 鹽 50% 硫酸銨 10% TCA編輯ppt樣品分析時第一步干什么? 想辦法得到各種信息 向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法 查文獻(xiàn)，如CA(化學(xué)文摘) 儀器制造商的文獻(xiàn)，如Waters 對色譜柱有足夠的了解 掌握分離機(jī)理，自己開發(fā)方法 充分了解您自己的樣品編輯ppt分析時要了解哪方面的情況？ 靈敏度的要求有多高? 樣品的本底是否很復(fù)雜? 有多少組份要分析? 對分析的精確度、準(zhǔn)確度等有多高要求? 是否因是日常檢驗，而要求方法

13、容易使用? 編輯ppt使用文獻(xiàn)方法 色譜柱填料的種類、品牌是否相同? 注意文獻(xiàn)方法的流動相 是否損害色譜柱? 如色譜填料品牌不同，需要調(diào)整流動相 注意色譜柱的規(guī)格：內(nèi)徑、柱長 需要調(diào)整流速、進(jìn)樣量 注意梯度條件 了解系統(tǒng)的滯后體積（梯度）編輯ppt反相色譜的方法開發(fā) 開發(fā)過程實例 色譜條件 色譜柱：C18，4mm30mm 流動相：乙腈/水，不同的溶劑強度，60/40、50/50、40/60，由強漸弱 流速：2ml/min 樣品： 對羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)編輯ppt改變流動相

14、比例60/4050/5040/60譜圖編輯ppt改變流動相組成 通過改變流動相改變選擇性 同樣強度的不同溶劑 改變色譜柱62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF編輯ppt離子型化合物的分離方式 使用離子交換柱 離子交換法 主要用于“強”陰、陽離子 使用反相柱 離子抑制色譜法 通過改變流動相的pH值，使樣品成中性 離子對色譜法 加入“對離子”，使樣品呈中性編輯ppt離子抑制色譜 離子型化合物在反相色譜柱上不保留 改變流動相的pH值，抑制樣品離子的電離 適用于弱酸性化合物的分離 降低流動相的pH值，使樣品降低離子化 使用硅膠基質(zhì)C18填料 使用條件應(yīng)在填料基

15、質(zhì)的范圍內(nèi) 硅膠柱的pH在2-8（較保險值3-7）內(nèi)編輯ppt常用緩沖液及其pH值編輯ppt離子抑制色譜實例 在乙腈/水及pH=7時，多數(shù)保留時間很短，無法完全分離。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234編輯ppt其他精密儀器操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程其他精密儀器操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)(SOP)要點要點高速冷凍離心機(jī)：高速冷凍離心機(jī)：配平、十字交叉十字交叉、樣品選擇普通離心機(jī)：普通離心機(jī)：配平、十字交叉、樣品選擇萬分之一電子天平：萬分之一電子天平：稱量量程范圍、記錄、保養(yǎng)紫外可見光分光光度計：紫外可見光分光光度計：預(yù)熱、樣品量、校準(zhǔn)渦旋振蕩器：渦旋振蕩器：渦旋程度超聲機(jī)：超聲機(jī)：超聲效果、時間編輯ppt藥代動力學(xué)實驗室的要求藥代動力學(xué)實驗室的要求1.環(huán)境的要求：灰塵、濕度、陽光是分析儀器的大敵2.所寫即所做3.分析測定用試劑為色譜純及以上，水為超純水4.痕量分析對實驗人員有較高要求5.對儀器設(shè)備的操作嚴(yán)格按照SOP執(zhí)行，專人管理和 維護(hù)保養(yǎng)6.良好的實驗習(xí)慣編輯pptHPLC-UVHPLC-UV測定加替沙星的血藥濃度如何著手？測定加替沙星的血藥濃度如何著手？查文獻(xiàn)：中國優(yōu)秀期刊論文數(shù)據(jù)庫、查文獻(xiàn)：中國優(yōu)秀期刊論文數(shù)據(jù)庫、pubmedpubmed需要關(guān)注的問題：色譜柱的選擇需要關(guān)注的問題：色譜柱的選擇 流動相的組成流動相的組成 柱溫箱的溫度柱溫箱的溫