PCR質(zhì)量控制2013326

1、1醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200673200673號）號）醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法（衛(wèi)辦（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)醫(yī)政發(fā)20101942010194號）號）醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則 ISO15189(CNAS-CL02)ISO15189(CNAS-CL02)醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在基因擴增檢驗領(lǐng)域的醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在基因擴增檢驗領(lǐng)域的應(yīng)用說明（應(yīng)用說明（CNAS-CL36CNAS-CL36）醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準則在病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準

2、則在病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用說明（用說明（CNAS-CL37CNAS-CL37） 分析前分析前患者準備、標本（采集、運送、驗收、保存）、醫(yī)患者準備、標本（采集、運送、驗收、保存）、醫(yī)生報告單申請生報告單申請 分析中分析中樣本分樣、儀器、檢測過程、結(jié)果的有效性判斷樣本分樣、儀器、檢測過程、結(jié)果的有效性判斷 分析后分析后檢測報告、報告?zhèn)鬟f、結(jié)果的接收、結(jié)果解釋檢測報告、報告?zhèn)鬟f、結(jié)果的接收、結(jié)果解釋標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響標本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響標本的類型和采集量標本的類型和采集量采樣及運輸容器采樣及運輸容器采樣質(zhì)量的評價采樣質(zhì)量的評價標本采集中的防污染標本采集中的防污染1 1、血清（

3、漿）血清（漿）：無特殊要求無特殊要求2 2、如用泌尿生殖道分泌物做如用泌尿生殖道分泌物做CTCT、NGNG項目：應(yīng)在抗生素應(yīng)用前或停項目：應(yīng)在抗生素應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗生素，應(yīng)于下次抗生素應(yīng)用藥兩周后采集標本，如不能停用抗生素，應(yīng)于下次抗生素應(yīng)用前采集。前采集。3 3、如用、如用痰痰做做TBTB：應(yīng)在抗結(jié)核藥物應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，：應(yīng)在抗結(jié)核藥物應(yīng)用前或停藥兩周后采集標本，如不能停用抗結(jié)核藥物，應(yīng)于下次抗結(jié)核藥物應(yīng)用前采集。如不能停用抗結(jié)核藥物，應(yīng)于下次抗結(jié)核藥物應(yīng)用前采集。 因為因為PCRPCR方法所檢測的靶物質(zhì)為核酸，不受標本生物活性的方法所檢測的靶物質(zhì)為核酸，

4、不受標本生物活性的限制，對于已經(jīng)死亡的病原體仍可檢測出來，即感染后在藥物限制，對于已經(jīng)死亡的病原體仍可檢測出來，即感染后在藥物治療有效的情況下，患處仍會有少量已死亡的病原體存在。治療有效的情況下，患處仍會有少量已死亡的病原體存在。 標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。標本的類型和采集量應(yīng)根據(jù)所測病原體而定。一般來說，如果樣本的量對病原體培養(yǎng)夠用的一般來說，如果樣本的量對病原體培養(yǎng)夠用的話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增話，則其量亦足以用于核酸提取及其后的擴增檢測。檢測。采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及采樣所用的抗凝劑及相關(guān)試劑材料不應(yīng)對核酸擴增及檢測過程造成干擾。如全血

5、、骨髓和血漿標本，用檢測過程造成干擾。如全血、骨髓和血漿標本，用EDTAEDTA抗凝，不使用肝素，因其是抗凝，不使用肝素，因其是 TaqTaq酶的強抑制劑，酶的強抑制劑，且在核酸提取過程中很難完全去除。且在核酸提取過程中很難完全去除。 使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，使用玻璃器皿，必須為密閉的、必須經(jīng)高壓滅菌，以使可能存在的以使可能存在的RNaseRNase永久性失活。永久性失活。血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收血液標本：溶血、嚴重脂血等應(yīng)拒收泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細胞存在。泌尿生殖道分泌物：鏡下觀察到上皮細胞存在。痰液：鏡下觀察上皮細胞很少，一般痰液：鏡下觀察上皮細胞很

6、少，一般102525個。個。標本拒收原因分析，采取有效措施予以糾正標本拒收原因分析，采取有效措施予以糾正實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條件實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床標本的運送條件（溫度、時間）作出相應(yīng)規(guī)定。（溫度、時間）作出相應(yīng)規(guī)定。靶核酸為靶核酸為DNADNA的標本，如在無菌條件下，則可以在室溫下運送，的標本，如在無菌條件下，則可以在室溫下運送，建議采集后建議采集后8h8h之內(nèi)送至實驗室；之內(nèi)送至實驗室；靶核酸為靶核酸為R RNANA的標本，如在無菌條件下，可在室溫下運送，如為的標本，如在無菌條件下，可在室溫下運送，如為較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議采

7、集后較長時間，則應(yīng)在加冰條件下運送，建議采集后4h4h之內(nèi)送至實驗之內(nèi)送至實驗室；室； 所有標本采集后送至實驗室之前，所有臨床標本在采集后送至所有標本采集后送至實驗室之前，所有臨床標本在采集后送至實驗室前，均應(yīng)放實驗室前，均應(yīng)放2 288臨時保存。臨時保存。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標本采集后應(yīng)立即送檢。淋病奈瑟菌有自溶的特性，標本采集后應(yīng)立即送檢。 靶核酸靶核酸( (尤其是尤其是RNA)RNA)易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本易受核酸酶的作用而迅速降解，因此標本的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要（避免反復(fù)凍融）的保存對于核酸擴增測定的有效性極為重要（避免反復(fù)凍融）靶核酸為靶核酸為DNA

8、DNA的標本的標本2-82-8保存保存1-31-3天，天，靶核酸為靶核酸為R RNANA的標本應(yīng)的標本應(yīng)2020下保存下保存2020下保存下保存1 1個月個月7070以下可長期保存以下可長期保存如為提取核酸后用于如為提取核酸后用于DNADNA擴增分析的樣本，可于擴增分析的樣本，可于10TE10TE緩沖液緩沖液mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.5mmol/L Tris,1mmol/L EDTA(pH7.58.0)2-88.0)2-8下保存。下保存。 用于用于RNARNA擴增分析的樣本，則應(yīng)于上述擴增分析的樣本，則應(yīng)于上述 TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存。保存。

9、標本接收建議在三個測定區(qū)之外標本接收建議在三個測定區(qū)之外接收的標本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從接收的標本應(yīng)收集在原始容器中，不能接受從其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本，其他檢測如生化、免疫檢驗等分出來的標本，因其有較大的發(fā)生標本間污染的可能性因其有較大的發(fā)生標本間污染的可能性 血清（漿）：血清（漿）：應(yīng)應(yīng)1 1小時內(nèi)分離血清，抗凝后小時內(nèi)分離血清，抗凝后4 4小時內(nèi)分離血漿，然后轉(zhuǎn)移至小時內(nèi)分離血漿，然后轉(zhuǎn)移至1.5ml1.5ml滅菌離心滅菌離心管中保存。若血清分離不充分，可管中保存。若血清分離不充分，可1500rpm1500rpm離心離心5min 5min 。如甘油三酯含量超過如甘油

10、三酯含量超過6mmol/L6mmol/L或肉眼可見血清或肉眼可見血清/ /血漿呈白色渾濁狀的標本，應(yīng)血漿呈白色渾濁狀的標本，應(yīng)413 000rpm413 000rpm離心離心15min,15min,吸取下層清亮血清或血漿轉(zhuǎn)移至吸取下層清亮血清或血漿轉(zhuǎn)移至1.5ml1.5ml滅菌離心管滅菌離心管中保存中保存 泌尿生殖道分泌物泌尿生殖道分泌物一次性采樣管（含保養(yǎng)液）一次性采樣管（含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液）配套棉拭子（不含保養(yǎng)液） 痰液痰液結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌DNADNA檢測標本：用檢測標本：用4%NaOH4%NaOH搖勻，室溫下放置搖勻，室溫下放置3030分鐘左右液化，分鐘左右液化，轉(zhuǎn)

11、移至轉(zhuǎn)移至1.5ml1.5ml滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的滅菌離心管，離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。需注意的是液化時不能加熱，液化時間不能過長。是液化時不能加熱，液化時間不能過長。 非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌DNADNA檢測標本：痰標本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分檢測標本：痰標本在室溫懸浮于滅菌生理鹽水中，充分震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提震蕩混勻，促使大塊黏狀物下沉，取上清離心，去上清，留沉淀用于核酸提取。取。切記不能用切記不能用NaOHNaOH液化痰標本液化痰標本。 分冊建立儀器檔案分冊建立儀器檔案儀器卡、儀器運行狀態(tài)

12、標識儀器卡、儀器運行狀態(tài)標識定期維護保養(yǎng)定期維護保養(yǎng)定期校準定期校準/ /檢定檢定相同檢測項目在不同的儀器或系統(tǒng)上進行檢測時，應(yīng)做比對相同檢測項目在不同的儀器或系統(tǒng)上進行檢測時，應(yīng)做比對 （2 2次次/ /年，每次至少年，每次至少2020份標本，計算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)份標本，計算回歸方程，系統(tǒng)誤差應(yīng)7.5%7.5%）當設(shè)備出現(xiàn)故障時當設(shè)備出現(xiàn)故障時 ： 1 1）應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標識）應(yīng)立即停止使用，并加上明顯標識 2)2)修復(fù)的設(shè)備必須經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方修復(fù)的設(shè)備必須經(jīng)校準、檢定（驗證）或檢測滿足要求后方 能再次投入使用能再次投入使用 3)3)實驗室應(yīng)檢查由于上

13、述缺陷對以前所進行的檢測工作的影響，實驗室應(yīng)檢查由于上述缺陷對以前所進行的檢測工作的影響， 并記錄相關(guān)分析、處理意見并記錄相關(guān)分析、處理意見 可校準的項目實施校準可校準的項目實施校準質(zhì)控品檢測結(jié)果在允許范圍內(nèi)質(zhì)控品檢測結(jié)果在允許范圍內(nèi)與其他儀器的檢測結(jié)果比較（與其他儀器的檢測結(jié)果比較（5 5個樣本，覆蓋測量范圍，個樣本，覆蓋測量范圍，至少至少4 4個樣本測量結(jié)果偏移個樣本測量結(jié)果偏移 7.5% 7.5% ）使用留樣再測結(jié)果進行判別使用留樣再測結(jié)果進行判別(5(5個樣本，覆蓋測量范圍，個樣本，覆蓋測量范圍，至少至少4 4個樣本測量結(jié)果偏移個樣本測量結(jié)果偏移 7.5% 7.5% ）需校準儀器：溫度

14、計、溫濕度計、移液器、恒溫金屬浴、生物安全柜、高需校準儀器：溫度計、溫濕度計、移液器、恒溫金屬浴、生物安全柜、高速冷凍離心機、擴增儀、雜交儀、測序儀速冷凍離心機、擴增儀、雜交儀、測序儀校準單位資質(zhì)校準單位資質(zhì)合格的校準合格的校準/ / 檢定報告檢定報告校準周期：參照國家計量部門或生產(chǎn)廠商的要求進行，廠家沒有規(guī)定的則校準周期：參照國家計量部門或生產(chǎn)廠商的要求進行，廠家沒有規(guī)定的則每年至少進行一次每年至少進行一次 內(nèi)部校準的輔助設(shè)備，實驗室應(yīng)根據(jù)國家計量部門或生產(chǎn)廠商的規(guī)定制定內(nèi)部校準的輔助設(shè)備，實驗室應(yīng)根據(jù)國家計量部門或生產(chǎn)廠商的規(guī)定制定內(nèi)部校準操作規(guī)程和要求，并有內(nèi)部校準的詳細記錄內(nèi)部校準操作

15、規(guī)程和要求，并有內(nèi)部校準的詳細記錄校準或檢定的設(shè)備，應(yīng)貼校準或檢定標貼，標明其校準或檢定狀態(tài)，并標校準或檢定的設(shè)備，應(yīng)貼校準或檢定標貼，標明其校準或檢定狀態(tài)，并標明下次校準或檢定的日期明下次校準或檢定的日期 結(jié)構(gòu)：溫度控制及導(dǎo)熱系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)：溫度控制及導(dǎo)熱系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng) 維護：維護： 75%75%乙醇定期清潔熱蓋和反應(yīng)槽或孔乙醇定期清潔熱蓋和反應(yīng)槽或孔 用無水乙醇清潔光路部分用無水乙醇清潔光路部分校準：校準： 校準單位：廠家校準單位：廠家 校準周期：定期校準、儀器搬動校準周期：定期校準、儀器搬動 校準參數(shù)：光路部分、背景熒光、溫控部分（溫度準校準參數(shù)：光路部分、背景

16、熒光、溫控部分（溫度準確度、均一性、溫度升降速率）確度、均一性、溫度升降速率） 維護：維護：75%75%乙醇擦拭加熱孔乙醇擦拭加熱孔校準：校準： 校準單位：廠家、計量院、內(nèi)部校準校準單位：廠家、計量院、內(nèi)部校準 溫度準確度（溫度準確度（11 ）（）（應(yīng)涵蓋試驗過程中所涉及的溫度應(yīng)涵蓋試驗過程中所涉及的溫度） 孔間溫度的均一性（孔間溫度的均一性（11 ）（內(nèi)部校準應(yīng)規(guī)定測定孔的（內(nèi)部校準應(yīng)規(guī)定測定孔的選擇、測量時間、各孔溫度偏差允許范圍）選擇、測量時間、各孔溫度偏差允許范圍）維護：維護： 75%75%乙醇擦拭乙醇擦拭校準：校準周期、外校（廠家、計量所）、校準：校準周期、外校（廠家、計量所）、 校

17、準量程校準量程（應(yīng)涵蓋試驗過程中所涉及的量程）（應(yīng)涵蓋試驗過程中所涉及的量程） 計量性能要求（容量允許誤差、測量重復(fù)性）計量性能要求（容量允許誤差、測量重復(fù)性）內(nèi)部校準內(nèi)部校準- -參照參照定量、可調(diào)移液器試行檢定規(guī)程定量、可調(diào)移液器試行檢定規(guī)程(JJG646-2006)(JJG646-2006) 注意：環(huán)境的要求注意：環(huán)境的要求 計量性能要求（標稱容量、標定點、容量允許誤差、測量計量性能要求（標稱容量、標定點、容量允許誤差、測量 重復(fù)性）重復(fù)性） 校準點涵蓋試驗過程中所涉及的量程校準點涵蓋試驗過程中所涉及的量程清潔清潔: 75%: 75%乙醇擦拭乙醇擦拭, ,不宜用次氯酸鈉溶液清潔不宜用次氯

18、酸鈉溶液清潔檢定：有資質(zhì)的第三方檢測機構(gòu)檢定：有資質(zhì)的第三方檢測機構(gòu)檢定參數(shù)：高效過濾器完整性、流入氣流流速、下降檢定參數(shù)：高效過濾器完整性、流入氣流流速、下降氣流流速、氣流模式氣流流速、氣流模式 維護保養(yǎng)：維護保養(yǎng)：75%75%乙醇擦拭乙醇擦拭校準：轉(zhuǎn)速、溫度校準：轉(zhuǎn)速、溫度耗材耗材 帶濾芯吸頭、離心管爆管和抑制物質(zhì)檢帶濾芯吸頭、離心管爆管和抑制物質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢試劑盒的質(zhì)檢 包括外觀質(zhì)檢和性能質(zhì)檢包括外觀質(zhì)檢和性能質(zhì)檢 選擇或更換試劑品牌：試劑性能評估選擇或更換試劑品牌：試劑性能評估 更換試劑批號：試劑批間差，應(yīng)評價核酸提取效率和更換試劑批號：試劑批間差，應(yīng)評價核酸提取效率和擴增效率擴增效

19、率設(shè)置陰性對照、低值陽性對照設(shè)置陰性對照、低值陽性對照試劑不合格試劑不合格 1)1)低值陽性對照和標準品均未檢出，或低值陽性對照未檢出而標準品檢出率大低值陽性對照和標準品均未檢出，或低值陽性對照未檢出而標準品檢出率大幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。幅下降，表示試劑失效或檢測靈敏度大幅下降。 2)2)低值陽性對照未檢出，標準品檢測正常，提示樣品提取液存在問題。重復(fù)新低值陽性對照未檢出，標準品檢測正常，提示樣品提取液存在問題。重復(fù)新舊提取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。舊提取液陽性對照實驗，確定提取液失效問題。 3) 3) 陰性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。陰

20、性對照有擴增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可能。 4)4)低值陽性對照檢出，標準品未檢出或擴增曲線明顯系統(tǒng)性低值陽性對照檢出，標準品未檢出或擴增曲線明顯系統(tǒng)性CTCT值偏大值偏大5 5個循環(huán)個循環(huán)以上，提示陽性標準品存在問題。以上，提示陽性標準品存在問題。試劑合格試劑合格 陰性對照無擴增、低值陽性質(zhì)控品檢出陰性對照無擴增、低值陽性質(zhì)控品檢出 或高、低兩個臨床樣本檢測結(jié)果在或高、低兩個臨床樣本檢測結(jié)果在0.4log100.4log10范圍內(nèi)，可接受范圍內(nèi)，可接受目的目的 監(jiān)測和控制實驗室常規(guī)工作的精密度，監(jiān)測和控制實驗室常規(guī)工作的精密度，即實驗室測定的批內(nèi)和批間重復(fù)性即實驗室測定的批內(nèi)和

21、批間重復(fù)性IQCIQC結(jié)果決定了實驗室即時測定結(jié)果的可靠性結(jié)果決定了實驗室即時測定結(jié)果的可靠性和有效性和有效性來源來源: :第三方、試劑盒自帶、自制第三方、試劑盒自帶、自制使用使用: : 1) 1)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，要確保所用溶劑的質(zhì)量；當溶凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，要確保所用溶劑的質(zhì)量；當溶劑為焦碳酸二乙酯（劑為焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）水時，在操作中應(yīng)盡量在）水時，在操作中應(yīng)盡量在通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。因通風(fēng)的條件下進行，并避免接觸皮膚。因DEPCDEPC是一種是一種潛在的致癌物質(zhì)潛在的致癌物質(zhì). .它可滅活各種蛋白質(zhì)，是它可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNARNA酶的強酶的強抑制物。抑制

22、物。 2)2)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，所加溶劑的量要準確凍干質(zhì)控品復(fù)溶時，所加溶劑的量要準確 3)3)凍干質(zhì)控品復(fù)溶時應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖凍干質(zhì)控品復(fù)溶時應(yīng)輕輕搖勻，切忌劇烈振搖 4 4）避免反復(fù)凍融）避免反復(fù)凍融 5 5）自制室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)監(jiān)測檢測全過程）自制室內(nèi)質(zhì)控品應(yīng)監(jiān)測檢測全過程 定性檢測定性檢測已知弱陽性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶至少帶1 1份，監(jiān)測核酸提取和擴份，監(jiān)測核酸提取和擴增檢測的有效性增檢測的有效性已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）：至少帶至少帶1 1份，判斷核酸提取過程中份，判斷核酸提取過程中是否發(fā)生污染是否發(fā)生污染( (實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標本間的交

23、叉污染、強陽性標實驗室的以前擴增產(chǎn)物的污染、標本間的交叉污染、強陽性標本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強陽性標本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染本氣溶膠經(jīng)加樣器導(dǎo)致污染、強陽性標本經(jīng)操作者手導(dǎo)致污染 翻蓋離心管在翻蓋離心管在較高溫度溫育時蓋子崩開、擴增反應(yīng)試劑的污染較高溫度溫育時蓋子崩開、擴增反應(yīng)試劑的污染 定量檢測定量檢測已知高、中、低質(zhì)控品（基質(zhì)與待測標本相同）已知陰性質(zhì)控樣本（基質(zhì)與待測標本相同）室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置室內(nèi)質(zhì)控品在擴增儀中的排列順序：不宜固定位置, ,盡盡可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性可能監(jiān)測每一個孔擴增有效性板上雜交和膜上斑點印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和板上雜交和膜上斑點

24、印跡雜交的質(zhì)控：在板上雜交和斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與斑點雜交時，陽性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標本平行進行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用病人標本平行進行分析，這可排除不同反應(yīng)中因使用不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。不同雜交條件所致的對結(jié)果的錯誤解釋。暫定均值的建立：暫定均值的建立：20d20d內(nèi)得到內(nèi)得到2020個數(shù)值，或至少在個數(shù)值，或至少在5d5d內(nèi)，每天作內(nèi)，每天作不少于不少于4 4次重復(fù)檢測獲得次重復(fù)檢測獲得2020個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔個數(shù)值。對數(shù)據(jù)進行離群值檢驗（剔除超過除超過3s3s外的數(shù)據(jù)），計算出均值，作為暫定均值。外的數(shù)據(jù)），計算

25、出均值，作為暫定均值。若使用定值質(zhì)控品，若使用定值質(zhì)控品，均值必須在實驗室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測定均值必須在實驗室內(nèi)使用自己現(xiàn)行的測定方法進行確定方法進行確定，質(zhì)控品說明書上的原有標定值只能作參考。，質(zhì)控品說明書上的原有標定值只能作參考。常規(guī)均值的建立：以最初常規(guī)均值的建立：以最初2020個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集個數(shù)據(jù)和三至五個月在控數(shù)據(jù)匯集的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，的所有數(shù)據(jù)計算的累積平均數(shù)作為質(zhì)控品有效期內(nèi)的常規(guī)均值，并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值。并以此作為以后室內(nèi)質(zhì)控圖的均值。符符 號號 定定 義義1 12S2S 一個質(zhì)控測定值超出一個質(zhì)控測定值超出2s

26、2s控制限。控制限。1 13S3S 一個質(zhì)控測定值超出一個質(zhì)控測定值超出3s3s控制限?？刂葡蕖? 22S2S 兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出兩個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+2s+2s或或2s2s控制限?？刂葡蕖 R4S4S 同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間同一批測定中，兩個不同濃度質(zhì)控物的測定值之間 的差值超出的差值超出4s4s控制限?？刂葡蕖? 41S1S 四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出四個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時超出+1s+1s或或1s1s控制限?？刂葡蕖?010X X 十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值的同一側(cè)。十個連續(xù)的質(zhì)控測定值同時處于均值的同一側(cè)。Levey-JenningsL

27、evey-Jennings質(zhì)控圖方法質(zhì)控圖方法 Levey-JenningsLevey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合質(zhì)控圖結(jié)合WestgardWestgard多規(guī)則質(zhì)控方法多規(guī)則質(zhì)控方法 “即刻法即刻法”質(zhì)控方法質(zhì)控方法 根據(jù)常規(guī)條件下的變異（根據(jù)常規(guī)條件下的變異（RCVRCV）計算中的平均值和）計算中的平均值和SDSD確定質(zhì)控線，確定質(zhì)控線，一般以一般以X X2S2S為告警限，為告警限，X X3S3S為失控限，將所得質(zhì)控結(jié)果標在一為失控限，將所得質(zhì)控結(jié)果標在一張質(zhì)控圖上，簡單明了。但如果以張質(zhì)控圖上，簡單明了。但如果以X X2S2S為失控限，假失控概率為失控限，假失控概率太高，通常不能接受；以

28、太高，通常不能接受；以X X3S3S為失控限假失控概率低，但誤差為失控限假失控概率低，但誤差檢出能力不強。檢出能力不強。 xl l 。XXX10X10 只要有只要有3 3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。將連續(xù)的質(zhì)控測定值按從小到大排列，即將連續(xù)的質(zhì)控測定值按從小到大排列，即x x1 1、x x2 2、x x3 3、x x4 4、x x5 5、x x6 6、xxn n（x x1 1為最小值，為最小值，x xn n為最大值）；為最大值）； 計算均值和標準差計算均值和標準差(s);(s);按下述公式計算按下述公式計算SISI上限上限和和SISI下限下限

29、值；值； SISI上限上限= =（x x最大值最大值 均值）均值）/s/s SI SI下限下限= =（均值（均值 x x最小值最小值 ）/s/s將將SISI上限上限和和SISI下限下限值與值與SISI值表中的數(shù)值比較。值表中的數(shù)值比較。 n nn n3s3s n n2s 2s n nn n3s3s n n2s2s 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 3 1.15 1.15 12 2.55 2.29 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 4 1.49 1.46 13 2.61 2.3 5 1.75 1.67 14 2.66 2.37 5 1.75 1.67 14 2.66

30、 2.37 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 6 1.94 1.82 15 2.71 2.41 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 7 2.10 1.94 16 2.75 2.4 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 8 2.22 2.03 17 2.79 2.47 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 9 2.32 2.11 18 2.82 2.50 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 10 2.41 2.18 19 2.85 2.53 11 2.48 2.23 20 2.88 2.56 11 2.48 2.23 20 2.

31、88 2.56SISI上限上限和和SISI下限下限值均值均 n3s對應(yīng)的值時，說明該質(zhì)控測定對應(yīng)的值時，說明該質(zhì)控測定值的變化已超出值的變化已超出3s3s，屬，屬“失控失控”。優(yōu)點：對于檢測項目開展次數(shù)少的實驗室可進行質(zhì)控優(yōu)點：對于檢測項目開展次數(shù)少的實驗室可進行質(zhì)控缺點：繁瑣缺點：繁瑣 初始階段的質(zhì)控數(shù)據(jù)，前初始階段的質(zhì)控數(shù)據(jù)，前3 3個質(zhì)控值的個質(zhì)控值的CVCV對隨后的結(jié)果對隨后的結(jié)果影響大。影響大。前前2020個數(shù)據(jù)使用即刻法，可對第個數(shù)據(jù)使用即刻法，可對第3 32020個數(shù)據(jù)進行質(zhì)控判斷個數(shù)據(jù)進行質(zhì)控判斷第第2121個數(shù)據(jù)開始使用常規(guī)質(zhì)控方法進行質(zhì)控判斷個數(shù)據(jù)開始使用常規(guī)質(zhì)控方法進行質(zhì)

32、控判斷及時查找原因，采取糾正措施及時查找原因，采取糾正措施填寫失控原因分析報告填寫失控原因分析報告相關(guān)負責(zé)人決定報告是否可發(fā)放相關(guān)負責(zé)人決定報告是否可發(fā)放核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑核酸提取中的隨機誤差。如核酸提取中的丟失、有機溶劑的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。的去除不徹底、標本中擴增抑制物的殘留等。 儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與儀器的問題。如擴增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等。所示溫度的不一致性等。試劑的問題。如試劑的問題。如TaqTaq酶和酶和/ /或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度或逆轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標記效率

33、和核酸提取試劑的效率等。及標記效率和核酸提取試劑的效率等。擴增產(chǎn)物的擴增產(chǎn)物的“污染污染” 臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉臨床標本的核酸提取過程中發(fā)生的標本間的交叉 “污染污染”. .嚴格的實驗室分區(qū)嚴格的實驗室分區(qū)使用帶使用帶“濾芯濾芯”的吸頭的吸頭設(shè)立設(shè)立“陰性陰性”質(zhì)控（與標本同時處理）質(zhì)控（與標本同時處理）使用防使用防“污染污染”（含（含UNGUNG）的）的PCRPCR試劑試劑臨床臨床“假陽性假陽性”問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療問題：病原微生物如結(jié)核桿菌經(jīng)藥物治療后已死亡，但后已死亡，但PCRPCR仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周內(nèi)不仍可為陽性，故治療結(jié)束后至少兩周

34、內(nèi)不宜做宜做PCRPCR檢測。檢測。避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來避免由于來自于標本的血紅蛋白、肝素、某些激素或來自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：自標本處理中的去垢劑、有機溶劑的抑制作用的措施：純化核酸；標本重復(fù)雙份測定；稀釋標本純化核酸；標本重復(fù)雙份測定；稀釋標本定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性定期對擴增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進行檢查和校準進行檢查和校準在在PCRPCR試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液，先將試劑準備區(qū)配置反應(yīng)混合液，先將dNTPdNTP、引物、酶和緩沖液混合后，再、引物、酶和緩沖液混合后，再分裝；分裝；配制反應(yīng)體系時，

35、應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，配制反應(yīng)體系時，應(yīng)注意移液器的使用方法，所有的液體都要緩慢加至管底，不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應(yīng)不要加至管壁，所有液體的混勻要用振蕩器進行，不能用移液器吹打，反應(yīng)體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡體系配制完畢后低速離心數(shù)秒，避免產(chǎn)生氣泡分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解分裝的試劑注意冷藏，防止酶試劑失活及有機大分子降解優(yōu)先選擇含優(yōu)先選擇含UNGUNG的試劑盒的試劑盒試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性試劑經(jīng)充分溶解后混勻，離心后再開蓋，保持試劑均勻性擴增管、樣品處理管及

36、吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌擴增管、樣品處理管及吸頭等實驗用品，均需高壓滅菌標本處理應(yīng)在標本制備區(qū)指定的生物安全柜內(nèi)進行，實驗前應(yīng)打開風(fēng)機標本處理應(yīng)在標本制備區(qū)指定的生物安全柜內(nèi)進行，實驗前應(yīng)打開風(fēng)機5-5-10min10min，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進行實驗操作，待柜內(nèi)空氣凈化并氣流穩(wěn)定后再進行實驗操作為防止標本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心為防止標本間交叉污染，在打開離心管前宜短暫離心如遇吸棄上清步驟的提取方法，離心時應(yīng)注意離心管的方向，吸棄上清如遇吸棄上清步驟的提取方法，離心時應(yīng)注意離心管的方向，吸棄上清時不要碰到沉淀部分，以免造成提取效率降低。時不要碰到沉淀部分，以免造成提

37、取效率降低。標本處理嚴格按照試劑說明書進行操作，應(yīng)做到處理時間充分，保證標標本處理嚴格按照試劑說明書進行操作，應(yīng)做到處理時間充分，保證標本中的本中的DNADNA或或RNARNA完全釋放；完全釋放；將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以將提取的核酸加到反應(yīng)體系中后，應(yīng)將純化好的剩余核酸樣本凍存，以免在擴增檢測時出現(xiàn)意外需要重新檢測。在結(jié)果確定后再將這些樣本按免在擴增檢測時出現(xiàn)意外需要重新檢測。在結(jié)果確定后再將這些樣本按生物污染廢棄物進行處理。生物污染廢棄物進行處理。擴增條件一致的不同檢測項目同時擴增時不得使用同一套標準品。擴增條件一致的不同檢測項目同時擴增時不得使用同一套

38、標準品。擴增后的擴增管不能在擴增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包擴增后的擴增管不能在擴增及產(chǎn)物分析區(qū)打開處理，應(yīng)用一次性手套包好遠離好遠離PCRPCR實驗室的洗滌間消毒處理；實驗室的洗滌間消毒處理；工作結(jié)束后，必須立即對各工作區(qū)進行清潔工作結(jié)束后，必須立即對各工作區(qū)進行清潔在判斷結(jié)果時，應(yīng)先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再在判斷結(jié)果時，應(yīng)先對擴增的熒光信號作出定性判斷，然后再進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾。進行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾?；€值（閾值）設(shè)定：遵從廠商規(guī)定基線值（閾值）設(shè)定：遵從廠商規(guī)定標準曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)等

39、參數(shù)的數(shù)值標準曲線平滑均勻，斜率、截距和相關(guān)系數(shù)等參數(shù)的數(shù)值允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍內(nèi)。允許變化范圍均應(yīng)在試劑制造商推薦的范圍內(nèi)。陰、陽室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果均處于在控狀態(tài)。陰、陽室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果均處于在控狀態(tài)。 以上幾項標準均達到要求后，當日實驗有效，可以發(fā)以上幾項標準均達到要求后，當日實驗有效，可以發(fā)放報告。否則，本次實驗無效，全部標本應(yīng)重新檢測。放報告。否則，本次實驗無效，全部標本應(yīng)重新檢測。定性測定中處于實驗灰區(qū)的標本應(yīng)重復(fù)檢測一次，灰區(qū)范定性測定中處于實驗灰區(qū)的標本應(yīng)重復(fù)檢測一次，灰區(qū)范圍的確定及結(jié)果報告應(yīng)遵從各試劑制造商推薦的要求。圍的確定及結(jié)果報告應(yīng)遵從各試劑制造商推薦的

40、要求。復(fù)星復(fù)星CTCT：38Ct38Ct值值4040為檢測灰區(qū)，建議重復(fù)檢測為檢測灰區(qū)，建議重復(fù)檢測2 2次。如次。如果檢測結(jié)果至少果檢測結(jié)果至少1 1次為次為Ct40Ct40判斷為陽性，否則判為陰性。判斷為陽性，否則判為陰性。達安達安CT:CT:ABI7000ABI7000：27Ct27Ct值值3030為檢測灰區(qū)，重復(fù)檢測為檢測灰區(qū)，重復(fù)檢測1 1次。如重次。如重復(fù)試驗復(fù)試驗CtCt值值3030判為陽性，否則判為陰性。判為陽性，否則判為陰性。Roche LightCyclerRoche LightCycler：37Ct4037Ct40為檢測灰區(qū)，重復(fù)檢測為檢測灰區(qū)，重復(fù)檢測1 1次。如重復(fù)試

41、驗次。如重復(fù)試驗CtCt值值4040判為陽性，否則判為陰性判為陽性，否則判為陰性定性檢測定性檢測 定性檢測的結(jié)果報定性檢測的結(jié)果報“陰性陰性”或或“陽性陽性”。但由于目。但由于目前國內(nèi)商品試劑盒的靈敏度多為前國內(nèi)商品試劑盒的靈敏度多為500-1000IU/ml500-1000IU/ml，在報告結(jié)果，在報告結(jié)果時應(yīng)告知臨床醫(yī)生方法的局限性。時應(yīng)告知臨床醫(yī)生方法的局限性。定量檢測定量檢測 1 1）結(jié)果在檢測范圍內(nèi)，則按檢測的結(jié)果直接發(fā)報告。）結(jié)果在檢測范圍內(nèi)，則按檢測的結(jié)果直接發(fā)報告。 2 2）樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則報告為）樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則報告為“低于檢測下限低于檢測下限”，不能，不能報告為報告為“0”0”或或“陰性陰性”。如果低于檢測下限，但又有擴增曲。如果低于檢測下限，但又有擴增曲線，則應(yīng)重新檢測，仍低于檢測下限，則報告為線，則應(yīng)重新檢測，仍低于檢測下限，則報告為“低于檢測低于檢測下限下限”。 3 3）結(jié)果高于檢測上限，則報告）結(jié)果高于檢測上限，則報告“高于檢測上限高于檢測上限”，如果需要，如果需要精確定量結(jié)果，則應(yīng)用陰性血清（漿）將樣本進行精確定量結(jié)果，則應(yīng)用陰性血清（漿）將樣本進行100-1000100-1000倍稀釋后再重新進行檢測，結(jié)果乘