選修1生物技術(shù)實踐知識點整理

1、選修1生物技術(shù)實踐第一部分 微生物的利用試驗1大腸桿菌的培育和分別一、大腸桿菌1大腸桿菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，為兼性厭氧的腸道桿菌。2用途：是基因工程技術(shù)中被廣泛接受的工具。二、本試驗的內(nèi)容是將大腸桿菌擴(kuò)大培育和劃線分別。分別后，一個菌體便會形成一個菌落，這是消退污染雜菌的通用方法，也是用于篩選高表達(dá)量菌株的最簡便方法之一。本試驗用LB液體培育基（通用的細(xì)菌培育基）擴(kuò)大培育大腸桿菌，培育后用LB固體平面培育基進(jìn)行劃線分別。三、 細(xì)菌的培育和分別1細(xì)菌的培育：（1）繁殖方式：細(xì)菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，約20min分裂一次。（2）培育的方法：需要將已有細(xì)菌的培育物轉(zhuǎn)移到新的培育基中，一般用

2、接種環(huán)來轉(zhuǎn)移帶菌的培育物。2細(xì)菌的分別分別的方法與特點：劃線分別法：操作簡潔。（接種環(huán)）涂布分別法：操作簡單，單菌落更易分開。（玻璃刮刀）四、滅菌操作1滅菌操作的緣由：獲得純潔的培育物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵污染。2無菌操作的條件：（1）各種器皿必需是無菌的。（首要條件）（2）各種培育基必需是無菌的?！凹?xì)菌喜葷，霉菌喜素”細(xì)菌培育基要用蛋白胨和酵母提取物來配制，還要加入肯定量的氯化鈉，以維持肯定的滲透壓。在中性偏堿的環(huán)境中生長（制備培育基時需調(diào)整培育基的酸堿度）。霉菌培育基一般用無機(jī)物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。在中性偏酸的環(huán)境中生長（制備培育基時需調(diào)整培育基的酸堿度）。假如培育基中有葡萄糖

3、，為防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2壓力（90 以上）滅菌30min.3滅菌的方法：是指殺滅病原微生物的方法。 （1）灼燒滅菌（2）干熱滅菌：160-170 下加熱1-2h。（3）高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 (1kg/cm2)下維持15min.（4）過濾滅菌：G6玻璃砂漏斗過濾（用于有些不能加熱滅菌的化合物，如尿素加熱會分解）4消毒的方法：是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法（1）煮沸消毒法：100煮沸5-6min（2）巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min（3）化學(xué)藥劑消毒法：用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源（4）紫

4、外線消毒五、大腸桿菌的培育和分別試驗1試驗步驟：（1）培育基滅菌：將50mlLB液體培育基、50mlLB固體培育基加上封口膜和培育皿用牛皮紙包好進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（封口膜的作用是既通氣又不使菌進(jìn)入）（2）倒平板：將有培育基的三角瓶和培育皿放到超凈臺上，打開紫外燈和過濾風(fēng)（3）接種：接種環(huán)接種，在37振蕩培育12h（4）劃線分別：在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，然后在固體培育基的平板上連續(xù)劃線，蓋好培育皿，將培育皿倒置，放在37恒溫培育箱中培育12-24h，可看到在劃線的末端消滅不連續(xù)的單個菌落。（5）菌種保存：用接種環(huán)取出單菌落，用劃線法接種在斜面上，37培育24h后，置

5、于4冰箱中保存試驗2分別以尿素為氮源的微生物一、脲和脲酶1脲或稱尿素，是蛋白質(zhì)降解的產(chǎn)物。2脲酶：有些細(xì)菌可以尿素為氮源，這些細(xì)菌含有脲酶（1）可降解尿素的酶（2）作用原理：細(xì)菌合成的脲酶能將尿素分解成NH3，致使pH上升，使酚紅指示劑變紅。二、試驗設(shè)計及步驟1試驗中的對比設(shè)置：試驗組：以全養(yǎng)分LB固體培育基進(jìn)行培育（蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉，瓊脂糖，水）對比組：以尿素固體培育基進(jìn)行培育（葡萄糖，氯化鈉，K2HPO4，酚紅，瓊脂糖，水）加入通過G6玻璃漏斗過濾（使之無菌）的10ml尿素溶液（內(nèi)含2g脲）2試驗步驟：（1）制備培育基：將已滅菌的LB固體培育基和尿素固體培育基在酒精燈旁分別倒入兩

6、個培育皿中，在水平的超凈臺上搖勻，平放至凝固。（2）制備細(xì)胞懸液：用1g土樣配制不同濃度的細(xì)胞懸液（加無菌水稀釋）。（3）用涂布分別法分別細(xì)菌：將不同濃度的土壤稀釋液分別加入到有LB培育基和尿素培育基的培育皿中，再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上火焰熄滅。在酒精燈火焰旁打開培育皿，將菌液涂布到整個平面上。（4）培育：倒置培育皿，在37恒溫培育箱中培育24-48h（5）觀看：培育基中的菌落數(shù)。試驗4果汁中的果膠和果膠酶一、果膠1化學(xué)組成：半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯2作用：（1）植物細(xì)胞壁的主要成分（2）將植物細(xì)胞粘合在一起（去掉果膠植物組織變得松散）3鑒別方法：果膠不溶于

7、酒精二、果膠酶1來源：黑曲霉、蘋果青霉等微生物2作用：3應(yīng)用：（1）應(yīng)用原理：水解果膠，使水果組織的分散性加大。（2）果汁生產(chǎn)：提高出汁率和澄清度。三、探究制作果汁的最佳條件試驗流程：95%的乙醇用于檢驗是否有果膠假如有渾濁（或者沉淀），說明果膠還沒有被完全水解。假如澄清，說明果膠被完全水解試驗6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測一、酶1功能：是生物體內(nèi)各種化學(xué)反應(yīng)的催化劑2特性：專一性和高效性3應(yīng)用的特點：在水溶液中很不穩(wěn)定，且不利于工業(yè)化使用。二、固定化酶1概念：將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑。2酶固定化的方法：吸附法、共價偶連法、交

8、聯(lián)法、包埋法等。將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時，在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物。三、-淀粉酶的固定化1固定化原理：利用吸附法將-淀粉酶固定在石英砂上?？隙舛鹊牡矸廴芤航?jīng)過固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示劑溶液測試，流出物呈紅色表明水解產(chǎn)物糊精生成這里使用的是枯草桿菌的-淀粉酶，其作用的最適溫度為5075；最適PH為5.57.52固定化過程：（1）在燒杯中將5mg-淀粉酶溶于4ml蒸餾水中（由于酶不純，可能有些不溶物）。（2）再加入5g石英砂,不時攪拌（3）30min后裝入1支下端接有氣門心并用夾子封住的注射器中(石英砂體積約4ml)（4）用10倍體積的蒸餾水洗滌此注射器以除去未吸附的游

9、離淀粉酶,流速為1ml/min3步驟：（1）淀粉溶液流經(jīng)固定化酶柱：將灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速過柱。（2）接取流出物：在流出5ml后接收0.5ml流出液。（3）流出物的鑒定：加入12滴KI-I2溶液,觀看顏色.用水稀釋1倍后再觀看顏色。（4）洗滌、保存固定化酶柱：用10倍柱體積的蒸餾水洗滌此柱,放置在4冰箱中保存。（5）幾天后取出冰箱中該固定化酶柱，再重復(fù)上述試驗,看是否有相同的結(jié)果。（可重復(fù)使用）把握流速的目的是使淀粉溶液與淀粉酶充分接觸。洗滌固定化酶柱的目的是洗去殘留的反應(yīng)物和產(chǎn)物。試驗8 果酒及果醋的制作一、用葡萄制作

10、葡萄酒1試驗原理：（1）與制作葡萄酒有關(guān)的微生物：酵母菌（2）制作葡萄酒所需原料：葡萄（3）制作原理：酵母菌在無氧條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵C6H12O6 2CO2 + 2C2H5OH（4）當(dāng)培育液中乙醇的濃度超過16%時，酵母菌會死亡。2試驗步驟：（1）沖洗：洗凈成熟葡萄，并在高錳酸鉀溶液中浸泡，然后用水洗凈。（2）榨汁：用榨汁機(jī)以低速將葡萄打成漿狀（3）制作酵母懸液：干酵母加水制成糊狀，加少許（一小撮）蔗糖，混勻，放置片刻，至酵母懸液中消滅氣泡。（4）裝入發(fā)酵瓶：將葡萄漿放入發(fā)酵瓶中，裝量不要超過2 / 3，然后加入酵母懸液，攪拌均勻，瓶上加軟木塞或橡膠塞，塞上帶有彎曲玻璃管（加水，防止O2進(jìn)入，

11、空氣中雜菌污染）。（5）酒精發(fā)酵：在25-30ºC條件下放置2-3天，若溫度偏低，則發(fā)酵時間延長；若溫度高于30ºC，要實行降溫措施，否則酒的風(fēng)味不佳。（6）過濾、分裝、保存：用兩層紗布過濾發(fā)酵液，除去葡萄皮和籽。同時可以用洗潔凈的手?jǐn)D壓濾渣，以獲得盡可能多的葡萄酒，分裝到1-2L細(xì)口瓶中，加蓋密封，靜置。待沉淀后，上清液即為葡萄酒。用這種簡潔工藝制造的葡萄酒，常溫下可保存1-2年。二、用果汁制作果酒1制作果酒材料（1）蘋果（最好）、梨、柑橘或其他水果（2）新穎酵母或干酵母2試驗步驟：（1）制取果汁：蘋果切成大塊，放在多功能榨汁機(jī)打碎，用兩層紗布過濾果汁（2）配料（以1L為

12、例）：向2L發(fā)酵瓶中加200g蔗糖，然后倒入果汁，轉(zhuǎn)動發(fā)酵瓶使蔗糖完全溶解，最終倒入酵母懸液（約1g干酵母），混勻，加蓋。（3）發(fā)酵：3天后可見氣泡，10天后猛烈的發(fā)酵停止，此時即可取出果酒過濾和分裝。（4）靜置：靜置5-6個月，上清液即為果酒，可用虹吸法取出三、用果酒制作果醋試驗原理：（1）與制作果醋有關(guān)的微生物：醋化醋桿菌如能獲得醋化醋桿菌的菌種，可在下列液體培育基中培育繁殖，配方：1L中含蛋白胨3g，酵母提取物5g，甘露醇25g（2）制作原理：醋桿菌在有氧的條件下才能將乙醇氧化為醋酸。醋桿菌所產(chǎn)生的醋酸可使培育液中醋酸的含量高達(dá)13%。C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O2

13、試驗步驟：（1）連接發(fā)酵裝置：在裝置的甲瓶中加入800mL酒水混合物（用鋁箔將上口蓋?。?。裝盒的乙瓶（發(fā)酵瓶）中裝入鋸末（八分滿），下口用雙孔橡膠塞連接發(fā)酵瓶和外界空氣及錐形瓶（丙瓶）。（2）加入醋化醋桿菌：將適量醋化醋桿菌的培育物加在200mL酒水混合物中混勻，并將pH調(diào)至7.0后倒入乙瓶中，使鋸末均勻濕透。（3）發(fā)酵并檢測pH ：將水族箱通氣泵的出氣管與乙瓶上塞棉花的玻璃管相連,通氣.不必太快，發(fā)酵48h,檢測PH,若明顯酸性,則進(jìn)入下一步.（4）調(diào)整活塞，把握流量：調(diào)整甲瓶下口的雙通活塞和乙瓶下口的螺旋夾，保持液體流量相同。（5）檢測pH，監(jiān)控發(fā)酵狀況：每天用pH試紙檢測流出液的pH，直

14、至pH不在削減，或者甲瓶中的液體全部流入乙瓶時，停止試驗。試驗10 泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測定一、泡菜腌制1有關(guān)微生物：泡菜制作時起主要作用的微生物是假絲酵母和乳酸菌。2泡菜制作原理：在無氧的條件下，微生物利用菜種的糖和其他養(yǎng)分物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物有有機(jī)酸和醇類物質(zhì)，其中也有亞硝酸（HNO2）。3泡菜制作流程：（1）預(yù)處理：將菜洗凈并切成小塊，洗凈泡菜壇，并加熱水洗內(nèi)壁。（2）加料入壇：將蔬菜、鹽水、糖、白酒、調(diào)味品等放入壇內(nèi)。假如期望發(fā)酵快些，可以將蔬菜在開水中浸1min后入壇，再加一些白酒（抑制雜菌生長）。（3）密封發(fā)酵：將壇口用水封好（防止外界空氣進(jìn)入），腌制1周。（加入泡菜汁更好，相

15、當(dāng)于接種已經(jīng)擴(kuò)增的發(fā)酵菌，削減腌制時間）（4）成品。二、亞硝酸鹽的定量測定1亞硝酸鹽測定原理：在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，再與N-1萘基乙二胺偶聯(lián)，形成紫紅色產(chǎn)物，可用光電比色法定量。將經(jīng)過反應(yīng)顯色后的待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)液比色，即可計算出樣品中的亞硝酸鹽含量。2亞硝酸鹽的定量測定流程：（1）樣品處理：泡菜25g及少量泡菜湯打成勻漿過濾，用氫氧化鈉（NaOH）將pH調(diào)至8.0，再加入25ml硫酸鋅至產(chǎn)生白色沉淀，水浴加熱至60ºC，過濾取濾液定容至500ml。（2）測定：10ml樣品溶液，加入4.5ml氯化銨緩沖液、2.5ml 60%乙酸溶液和5ml顯色液，定

16、容至25ml，暗處靜置25min，用光程為1cm的比色杯在550nm處測定光密度值。（以10ml水為空白對比）（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取0、0.5、1.0、3.0、5.0ml亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別放在25ml定量瓶中，各加入4.5ml氯化銨緩沖液、2.5ml 60%乙酸溶液和5ml顯色液，定容至25ml，暗處靜置25min，用光程為1cm的比色杯在550nm處測定光密度值。以亞硝酸鈉質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以光密度值（OD值）為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）計算： X1= m2×1000 ×V1 / m1× 1000 × V2 式中：X1樣品中亞硝酸鹽含量 單位：mg/

17、kgm1樣品中亞硝酸的含量 單位：gm2標(biāo)準(zhǔn)曲線中亞硝酸鹽含量 單位：ug V1 樣品處理液總體積。 V2 測定用的樣品處理液體積。 試驗11 植物的組織培育一、植物組織培育1概念：取一部分植物組織，如葉、芽、莖、根、花瓣或花粉等，在無菌條件下接種在三角瓶中的瓊脂培育基上，賜予肯定的溫度和光照，使之產(chǎn)生愈傷組織，或進(jìn)而生根發(fā)芽。2培育基中加入的激素（1）激素的種類：生長素和細(xì)胞分裂素（2）激素的使用比例比例結(jié)果細(xì)胞分裂素/生長素比例高誘導(dǎo)芽的生成（從狀苗）細(xì)胞分裂素/生長素比例相當(dāng)愈傷組織連續(xù)生長不分化細(xì)胞分裂素/生長素比例低趨于長根3試驗中使用的激素：人工合成的萘乙酸（NAA）代替生長素人工合成的芐基腺嘌呤（BA）代替細(xì)胞分裂素二、菊花的組織培育材料：1.MS培育基:由大量元素、微量元素和有機(jī)成分組成（用于配置發(fā)芽和生根培育基）2.萘乙酸（NAA）用少量0.1mol/L NaOH溶液溶解芐基腺嘌呤（BA）用少量0.1mol/L HCl溶液溶解3.發(fā)芽培育基：MS培育基+芐基腺嘌呤（BA）+萘乙酸（NAA）+蔗糖+瓊脂+蒸餾水4.生根培育基：MS培育基+萘乙酸（NAA）+蔗糖+瓊脂+蒸餾水步驟：1取外植體：超凈臺上將無菌幼苗切段，每段至少1張葉片。2生芽培育：在酒精燈旁，將每段放入一瓶生芽培育基中，使莖的一部分插入培育基內(nèi)，蓋