遺傳性疾病基因治療臨床研究現(xiàn)狀

1、    遺傳性疾病基因治療臨床研究現(xiàn)狀        基因治療是一種應用基因工程技術和分子遺傳學原理對人類疾病進行治療的新療法。自1990年9月世界上第1例腺苷脫氨酶缺乏所致的重癥聯(lián)合免疫缺陷病患者接受基因治療以來，基因治療臨床研究取得了很大進展。我們就近幾年遺傳病基因治療臨床研究進展及現(xiàn)狀作一介紹。 1臨床基因治療研究的總體情況截至1997年6月，全世界已批準的臨床基因治療方案有218項1，2，其中美國184項，包括基因標記30項，腫瘤基因治療103項，單基因病27項，人免

2、疫缺陷病毒(HIV)19項，其它疾病5項；其他國家有34項，也多為腫瘤基因治療。接受基因治療和基因轉移的患者總數(shù)近幾年呈直線上升，1994年底尚不足500例，至1996年12月已逾2000例。所用的基因轉移載體逆轉錄病毒(retrovirus,RV)占56%，質粒載體占24%，腺病毒(adeno-virus,Ad)占10%，腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)占1%。一個重要的趨勢是經體內途徑(in vivo)進行基因治療的比例上升，1994年體內途徑和體外途徑(ex vivo)分別為41%和59%，而1996年分別為61%和39%。提示體內途徑因簡便、適用而受到

3、人們的重視。2遺傳病基因治療的概況遺傳性疾病是由于人體內遺傳物質改變所引起的疾病，目前大多數(shù)單基因遺傳病尚無有效的根治方法。理論上，通過基因治療修正缺陷的基因是治療單基因遺傳病的根本途徑。迄今已有12種遺傳性疾病(表1)，30余個遺傳病臨床基因治療方案被批準1，2，約占目前世界上批準進行的臨床基因治療方案的16%，200多個遺傳病患者接受了基因治療，約占接受基因治療患者總數(shù)的10%。表1全球遺傳病基因治療臨床方案及治療的病例數(shù)疾病方案數(shù)病例數(shù)囊性纖維變性19176ADA缺陷的重癥聯(lián)合免疫缺陷癥413Gaucher病39家族性高膽固醇血癥15慢性肉芽腫病15血友病B14Fanconi貧血13X連

4、鎖的重癥聯(lián)合免疫缺陷病11-抗胰蛋白酶缺陷癥1嘌呤核苷酸化酶缺陷癥1Hurler's綜合征1Hunter綜合征113已實施的遺傳病基因治療代表性方案 3.1T淋巴細胞和(或)造血祖細胞為靶細胞的體外途徑以腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)缺陷所致的重癥聯(lián)合免疫缺陷病(severe combined immune deficient,SCID)基因治療最具代表性。ADA缺陷癥是一種常染色體隱性遺傳性疾病，其基因定位于染色體20q13，cDNA長1533bp，編碼362個氨基酸殘基3。ADA缺陷癥的基因治療是最早獲得政府機構批準的人類基因治療研究，目前已有5個臨床

5、研究方案正在進行，14個患者得到治療。美國國立衛(wèi)生研究院Blease等4，于1990年9月應用患兒外周血淋巴細胞作為靶細胞，進行了世界上第1例臨床基因治療研究。從患兒外周血分離出單個核細胞，用重組人IL-2和CD3單抗刺激T細胞增殖，以LASN逆轉錄病毒載體轉染，使ADA基因穩(wěn)定整合，擴增T細胞后回輸。治療后患兒T細胞數(shù)上升，細胞和體液免疫功能及臨床癥狀明顯改善，隨訪5年仍可在兩名患兒體內T細胞中測得轉入的載體序列，其他免疫指標檢測也證實其長期作用4。Bordignon等5應用兩個結構不同的逆轉錄病毒載體DCAl和DCAm分別轉染外周血淋巴細胞和骨髓造血干細胞治療兩例ADA缺陷癥。例1接受了7

6、.34×108DCAl轉導的外周血淋巴細胞和0.35×108DCAm轉導的骨髓造血祖細胞。16個月后，患者體內G418抗性T細胞和骨髓前體細胞數(shù)分別為4.76%和25%。有趣的是開始時，來源于循環(huán)淋巴細胞的DNA和骨髓細胞的DNA擴增，可分別測到DCAl載體和DCAm載體；1年以后，外周血淋巴細胞中可同時測到DCAl和DCAm載體，且表達DCAl載體的淋巴細胞迅速減少，被表達DCAm載體的T細胞所取代。另一患者獲類似結果，提示在612個月的短期免疫功能重建可能是由外周血淋巴細胞所致，而長期重建則由轉基因骨髓細胞引起。此外荷蘭、日本的學者也分別進行了造血祖細胞ADA基因治療6

7、。3.2以皮膚成纖維細胞為靶細胞的體外途徑基因治療方案1991年我國復旦大學遺傳學研究所與第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院血液科合作進行的血友病B基因治療是這一方案的代表7，8。血友病B又稱凝血因子(factor ,F)缺乏癥，是一種性連鎖隱性遺傳性出血性疾病，其基因位于Xq26.3-27.1，編碼順序長1383bp9。該方案應用XLCIX和N2CMVIXC9逆轉錄病毒載體轉染患者的成纖維細胞，以細胞膠原懸液注射到患者皮下，使患者血漿中F抗原和F活性升高12倍，并持續(xù)2年以上，鼻出血等癥狀有所好轉，每年所需輸血次數(shù)減少。此后又進行了2例血友病乙基因治療，隨訪47年未發(fā)現(xiàn)與基因治療相關的毒副反應，但轉入的因

8、子表達水平仍有待進一步提高。3.3以肝細胞為靶細胞的體外途徑基因治療Wilson領導的研究組應用這一方案治療了家族性高膽固醇血癥(familial hyperchlesterolaemia,FH)10，11。FH是一種由低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)功能或表達異常所致的遺傳病，有兩種遺傳方式，一種為多基因遺傳，另一種為常染色體顯性遺傳。LDLR基因位于染色體19p13.2，編碼順序為2.5kb。該方案經部分肝切除獲取原代培養(yǎng)的肝細胞，在體外應用含LDLR cDNA的逆轉錄病毒載體感染后回輸，LDLR cDNA由-actin啟動子

9、和CMV早期基因增強子控制轉錄，基因轉染效率為20%100%。移植物經門靜脈注射植入肝臟，患者血液中LDL水平較治療前下降約30%，LDL/HDL(高密度脂蛋白)之比從治療前1013降至58，這一水平維持了18個月以上。由于該方案需要切除患者約1/3的肝臟，目前已經停止研究，認為不經改進不宜進一步擴大治療患者10，11。3.4腺病毒等載體介導的體內基因治療體內途徑的基因治療以其方便、實用而越來越受到人們的重視，所用載體以腺病毒為主，在腫瘤性疾病的基因治療中應用較多，而在遺傳病，目前主要見于囊性纖維變性(cystic fibrosis,CF)的基因治療研究。CF是一種白種人常見的致死性疾病，為常

10、染色體隱性遺傳。該病是由于跨膜轉導因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突變，導致上皮細胞氯離子通道異常，肺、肝、胰、腸等多器官功能損害。CFTR基因定位于7q染色體，cDNA長約6.5kb。在CF累及的器官中目前只有肺作為基因治療的靶器官。在所有的遺傳病基因治療方案中，以CF最多(表1)，均為體內途徑。主要用腺病毒載體(9項)，此外尚有脂質體-質粒(3項)和腺相關病毒載體(3項)1，2，12-14。Crystal等12應用AdCFTR對4名患者進行治療時發(fā)現(xiàn)，應用較低病毒滴度水平(2×106pfu

11、)即可在呼吸道上皮中測到轉入CFTR的表達，隨訪612個月發(fā)現(xiàn)慢性炎性副反應。Knowles等13應用腺病毒載體將不同滴度Ad5CB-CFTR轉入12名患者呼吸道上皮細胞，RT-PCR證實基因轉入，所用病毒滴度低時，轉基因上皮細胞比例1%，離子轉運功能無明顯改善；應用高滴度病毒時，3名患者中有2名出現(xiàn)粘膜炎癥。多數(shù)研究表明，基因治療糾正了呼吸道上皮的氯離子轉運缺陷，跨上皮基礎電位下降，有報道治療后肺功能有所改善。3.5其它進入臨床研究的遺傳病及其方案如Gaucher病(葡萄糖腦苷脂酶缺陷癥)、Fanconi貧血、Hunter綜合征等，見表1和表2。表2遺傳性疾病臨床基因治療的概況病名基因靶細胞

12、載體途徑機構囊性纖維變性CFTR呼吸道上皮細胞AdAAV脂質體體內美國國立衛(wèi)生研究院SCIDADA淋巴細胞、CD34+細胞RV體外美國國立衛(wèi)生研究院Gaucher病葡萄糖腦苷脂酶CD34+外周血干細胞RV體外美國匹茲堡大學1-抗胰蛋白酶缺陷癥1抗胰蛋白酶鼻、呼吸道上皮細胞脂質體體內美國范德比爾特大學Fanconi貧血FACCCD34+外周血干細胞RV體外美國國立衛(wèi)生研究院Hunter綜合征艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶外周血干細胞RV體外美國密尼蘇達大學慢性肉芽腫病p47/phoxCD34+外周血干細胞RV體外美國國立衛(wèi)生研究院血友病B凝血因子成纖維細胞RV體外上海復旦大學和長海醫(yī)院嘌呤核苷磷酸化酶缺

13、陷嘌呤核苷磷酸化酶外周血淋巴細胞RV體外美國密尼蘇達大學轉氨基甲酰鳥氨酸酶缺陷轉氨基甲酰鳥氨酸酶肝臟Ad/5體內美國賓州大學X-連鎖SCID細胞因子共同鏈CD34+細胞RV體內美國洛杉磯兒童醫(yī)院4存在的問題及今后的努力方向 基因治療進入臨床近10年，其發(fā)展已經渡過了初期階段的浮躁，進入了理性發(fā)展階段。成功的基因治療應以安全、有效、簡便、實用為目的。目前已實施的臨床基因治療方案均不夠成熟，臨床療效尚不確切，但未發(fā)現(xiàn)基因治療相關的癌變等嚴重并發(fā)癥。例如ADA缺陷癥的基因治療雖然使患者的淋巴細胞數(shù)增加，免疫功能改善，但由于患兒在接受基因治療的同時，仍在接受PEG-ADA替代治療4，5，使基因治療效果

14、的評價欠明確。血友病B基因治療雖然使患者血漿F水平增高，出血癥狀改善，但表達水平和持續(xù)時間均有待于進一步提高7。同時體外途徑基因治療方案費事、耗時，不夠實用。有學者應用重組腺病毒載體進行體內途徑F基因治療，并應用免疫抑制劑以克服免疫反應，但動物體內F表達水平在9周后仍漸下降，再次注射無效，可能與產生載體相關抗體有關。CF患者經CFTR基因轉移后，呼吸道上皮膜電位改善，但離最終治療目標即肺功能的改善和疾病的逆轉尚有距離12-14。目前需要進一步研究提高轉基因體內表達水平，以提高臨床療效。近年來在載體的研究上有不少突破。例如新近報道用無病毒基因的腺病毒載體插入1-抗胰蛋白酶全長基因，包括肝細胞特異

15、性啟動子，獲得了在動物體內長期高水平穩(wěn)定表達15，并在保持腺病毒載體轉染效率的基礎上增加了安全性。應用雜合病毒載體如Ad/AAV載體，取各病毒之長，也取得了一定的進展。對于脂質體-質粒載體的研究則需進一步明確其理化特性，應用分子粘附連接分子提高脂質體的轉染效率，有報道應用受體-脂質體-質粒載體復合物進行轉染。其他如AAV已用于CF臨床基因治療，血友病B臨床治療也已申請。選擇合適的治療時機對某些疾病也很重要。例如有人認為，CF的肺損害病程可分為兩個階段，早期為CF階段，晚期為肺疾病階段，其間有個轉變點(point of no return,PNR)。CFTR功能的恢復只在早期階段有效，故應以早期

16、患者為治療對象，治療目的是推遲或阻斷PNR的到來16。此外因子基因撬除血友病B小鼠模型的建立及AAV載體在動物體內的高水平持久表達也為F基因治療研究帶來了新的希望17，18?？傮w上說，盡管人類基因治療目前離成熟的臨床治療技術還有相當?shù)木嚯x，但經過近10年的臨床試驗，人們已經獲得了大量寶貴的臨床資料。許多實驗室對基因治療的一些基本問題進行了深入研究，例如基因轉移載體的進一步優(yōu)化，新一代載體的研制和開發(fā)，對眾多遺傳性疾病的病理生理特性及基因表達與調控的研究，已經取得較大進展，必將使基因治療技術進一步成熟和實用，我們有理由相信，隨著人類基因組計劃的順利實施和完成，新的人類疾病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆，基因治

17、療基礎研究的不斷進步，基因治療技術將在不遠的將來取得突破性進展，為人類健康作出重大貢獻。本課題受國家自然科學基金(39370321)和1997年度上海市科委留學回國人員啟動基金資助作者單位：200433上海，第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院血液科參考文獻1The TMC Worldwide Gene Therapy Enrollment Report, end 1996 editorial.Hum Gene Ther,1997,8(6)775-800.2Department of Health and Human Services National Institutes of Health Recom

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