肺炎球菌1型莢膜多糖多克隆抗體制備與夾心ELISA法建立及其在多糖濃度測定中的應用.docx

1、論著*肺炎球菌1型莢膜多糖多克隆抗體制備與夾心ELISA法建立及其在多糖濃度測定中的應用劉威，廖紅梅，謝謙，黃放，鄒莎莎，馬誠，江山，崔長法(成都生物制品研究所有限責任公詞細函性疫苗研究室，四川成都610023)摘要：目的利用肺炎球菌1型全菌體制備多克隆抗體，并旦利用該抗體建立肺炎1型英膜多糖夾心解聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA),用于檢測發(fā)酵和純化過程中的多糖濃度。方法用滅活的1型肺炎鏈球菌免疫家兔6周，獲得高滴度的抗多糖血清，經過親和層析純化，獲得高純度的兔抗肺炎1型多械抗體IgG。以純化IgC作為包被抗體，加入多犧樣品,再以生

2、物素化的抗體作為檢測抗體，建立夾心ELISA法檢測肺炎1型多糖濃度。確定標準曲線的最佳線性范圍，并對該方法進行特異性、準確性和精密度驗證。結果兔免疫血清經過雙向免疫擴散檢測抗體滴度可達1：32；該方法的線性檢測范圍為1.5650n”mL；最低檢測限為3.13n"mL。在標準品中混入其他型別多糖或培養(yǎng)基，回收率分別為102%和108%;該方法批內精密度和批間精密度分別為6.08%和7.01%。結論建立的夾心ELTSA方法，其特異性、準確性和精密度均良好，可以特異地檢測肺炎球菌1型多糖濃度。關鍵詞:肺炎球菌1型多糖;免疫學檢測法;夾心EUSA；多糖濃度中圖分類號：R378.P4文獻標志碼

3、：A文章編號：1005-5673(2013)05-0001-05Preparationofpolyclonalantibodiesagainstpneumococcalserotype1capsularpolysaccharideanddevelopmentasandwichELISAindeterminationofconcentrationfbrtype1capsularpolysaccharideUUWei,LIAOHong-mei,XIEQian,HUANGFang,ZOUSha-sha,MACheng,JIANGShan,CUIChang-fa(DepartmentofBacteri

4、alVaccineResearchandDevelopment,ChengduInstituteofBiologicalProducts,Co.,Lid,Chengdu610023,China)Abstract:ObjectiveTopreparepolyclonalantibodiesagainstcapsularpolysaccharideofpneumococcalserotype1,andusetheantibodiestodevelopasandwichELISAindeterminationofconcenlralionforpneumococcalcapsularpolysacc

5、harideofserotypeIintheprocessoffermentationandpurification.MethodsHightiterserumofanti-capsularpolysaccharideserotype1wasobtainedafterimmunizingrabbitsbyusingofinactivatedstreptococcuspneumoniaecellsofserotype1fbr6weeks.IgGwaspurifiedthroughaffinitychromatographyandusedasacoatingantibody.Polysacchar

6、idesamples,alonewithinhousepolysaccharidestandard,werethenaddedfollowedbyusingbiotinylatedantibodyasasignalantibody.Theoptimalinearrangeofthestandardcurve,specificity,accuracyandprecisionofthedevelopedmethodwerevalidatedaccordingly.ResultsTheantibodytiterofrabbitimmuneserumreachedto1：32,thestandardP

7、SIlineardetectionrangewas1.56ng/mLto50ng/mL,detectionlimitwas3.13ng/mL.Standardpolysaccharidewasmixedwithpolysaccharidesfromdifferentsenrtypesorculturemediabeforeasssay,therecoveryratiowas102%and108%respectively.Intra-as-sayprecisionandinterprecisionofthemethodwere6.08%and7.01%.ConclusionHightiterra

8、bbitanti-serumagainsttype1capsularpolysaccharideofstreptococcalpneumoniaewasprepared.ThedevelopedsandwichELISAmethodshowedhighspecificity,goodaccuracyandprecision.Thismethodcanbeusedinspecificdetectionofconcentrationforpneumococcalpolysaccharideserotype1.Keywords:Pneumococcalpolysaccharideserotype1;

9、Immunoassay;Sandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay(S-EL1SA);Polysaccharideconcentration收稿日期：20I3-06-25;修回日期：2013-07-14作者簡介:劉威(1978-)，男，碩上,主要從事細菌性疫苗的研發(fā)工作。肺炎鏈球菌是引起肺炎、腦膜炎、中耳炎的主要病原體。美國有觀察資料顯示，估計每年有40-50萬人罹患肺炎球菌性肺炎，病死率為5%10%o盡管使用有效的抗生素治療，肺炎球菌感染仍可引起很高的發(fā)病率和病死率。接種肺炎莢膜多糖疫苗能夠有效降低肺炎鏈球菌感染的發(fā)病率和病死率。制備肺炎莢膜多糖疫苗過程，

10、尤其是發(fā)酵和純化過程中，進行多糖濃度監(jiān)測，對優(yōu)化發(fā)酵和純化工藝、提高多糖產率非常必要。通常，檢測肺炎莢膜多糖的方法為依賴硫酸降解的化學顯色法，但是該類方法主要用于純化后的多糖產品，不適合于雜質較多、濃度不高的多糖中間樣品。為了提高檢測的特異性和靈敏度,前人開發(fā)出免疫學方法,如速率散射比濁法和火箭免疫電泳法，但這些方法存在特殊設備要求、重復性不佳或血清需求量過大等限制因素。本研究通過全菌體免疫家兔，對血清進行純化和生物素標記，獲得高純度抗肺炎球菌1型莢膜多糖（Pneumococcalcaspularpolysaccharideserotype1,PnPSl）多克隆抗體,建立夾心酶聯(lián)免疫吸附法（E

11、nzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA），經過方法學驗證后，對發(fā)酵的肺炎球萌1型多糖濃度進行檢測，證明該方法的實用性。1材料與方法1.1菌種肺炎鏈球菌1型菌種由成都生物制品研究所有限責任公司（以下簡稱成都公司）提供，利用血清學方法鑒別血清型別是否正確。1.2試驗動物SPF級新西蘭大耳白兔，雌性，體重2.5kg,由成都公司動物室提供。1.3主要試劑PnPsl內部標準品由成都公司提供，批號CE20111031,見表1;A蛋白4FF親和層析填料購自AppliedBiosystems公司；生物素化標記試劑盒和HRP標記親和素購自Therm。公司；TMB購官KPL公司；

12、氟氏完全佐劑購自Sigma公司；標準肺炎球菌分型診斷血清購自丹麥血清研究所，批號G113b。表1肺炎球菌1型多糖標準品的質控結果Tab.IQualitycontrolresultforstandardPSIinhouse批號蛋白（%）核酸（%）相對分子質量（kD）糖醛酸（%）氧乙?；?）總磷（）總氮（）CE201110310.720.810.0352.005.200.273.201.4菌液制備肺炎1型鏈球菌接種于液體肉湯培養(yǎng)基（由成都公司提供），以10%C02于36丁經二級發(fā)酵共培養(yǎng)46h,用丹麥血清做凝集試驗確定細萌血清型別為肺炎球菌1型;取少量菌液染色鏡檢，確定細菌生長狀態(tài)良好，莢膜完整

13、；用麥氏比濁法確定細菌濃度。利用100T水浴滅活細菌30min,2000g離心5min,生理鹽水洗滌菌體后，立即免疫動物。1.5動物免疫及血清抗體滴度檢測初次免疫菌濃度為2x108個/mL,混合等體積福氏完全佐劑，多點注射于家兔皮下。此后，每周由耳緣靜脈注射滅活全菌體1次，每次2X109個萌,共免疫5次。用雙向免疫擴散確定抗體滴度至1：32o立即頸動脈采血，分離血清，保存于-20ro1.6多克隆抗體的純化與標記PBS平衡兔血清至pH7.0,用A蛋白親和柱吸附抗肺炎球菌1型多糖抗體，用pH3.。檸檬酸洗脫抗體，經12%還原SDS-PAGE和高效液相色譜（HPLC）分析鑒定純度。純化的抗體按照生物

14、素化試劑盒說明，進行生物素標記。1.7夾心ELISA方法的優(yōu)化將肺炎球菌1型多糖抗體和標記抗體系列稀釋，采用方陣滴定法確定二者的最佳工作濃度。建立步驟如下:在96孔酶標板中用pH9.6碳酸緩沖液包被1如分別為0.05白g/mL、0.15瞄/mL、0.45jig/mLJOOpX/孔,28T過夜孵育。次日洗板,加入含3%BSA的封閉液,200jit/孔，室溫封閉1h；洗板3次，分別加入30ng/mL標準肺炎球菌1型多糖作為陽性對照或PBS作為陰性對照，室溫孵育1h；洗板，加入1：3000至1:100000系列稀釋生物素標記抗體JOOjiiy孔，孵育1h；加入HRP標記親和素，反應1h；洗板后,TM

15、B顯色,0.5mol/LH2SO4終止顯色反應，酶標儀讀取4切值。根據(jù)信/噪比最大原則，判斷最適合的包被濃度和檢測抗體濃度。注：PS：PnPSI；孔1：丹麥1型旬清”1/4；孔2、孔3、孔4、孔6：口制免血清，分別稀襟1/4.1/8.1/16,1/32；孔5：陰性對照圖1雙向免疫擴散測定肺炎球菌I型兔免疫血清抗體效價Fig.IDeterminationoftherabbitantilxxlylitersagainstpneumoniatypeIbydoubleimmunodifTusion140000100()005000()-44HMNI35(XM)25(MM)注：l8為系列稀擇的純化后肝樣

16、品；M蛋白分子ht標準(260000.1400(X).100000,70000,50000,40000.35000.25000)圖2還原SDS-PAGE檢測IgG分子量及純度Fig.2ReducedSDS-PAGEprofileofpurifiedrabbitanli-PnPSIsrnim注：PS：PnPSI；孔l：丹麥I羽旬清稀釋1/4；孔2,孔3、孔4、孔6：自制兔血清.分別稀釋1/4J/8J/16J/32；孔5：陰性對照圖3純化的兔抗肺炎球菌1型多糖IgG抗體的HPLC圖譜Fig.3Th<*IIPIXIpnifilrMrabbitIgGantibodyagainstpnetim&l

17、t;K-(K-(-alpolysaccharidesertrtypeI1.8標準曲線的確立根據(jù)上述優(yōu)化條件，將肺炎球菌I型多糖(PnPsI)標準品稀釋至1.56100.00ng/mL,選擇相關系數(shù)大于0.98,4詢在0.10-2.00標準多糖稀釋區(qū)間為最佳線性范圍。1.9方法驗證1.9.1特異性將PnPsl標準械溶于混有12種其他肺炎球菌血清型多糖(3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、I8C、19F、19A、23F,每塑終質量濃度50.00ng/ml.)的溶液中,用建立的夾心ELISA法檢測其中I型多糖濃度，il算回收率。將標準多糖按照6.25ng/mLJ2.50ng/mL、25.00n

18、g/mL溶解于肉湯培養(yǎng)基中，計算其回收率。1.9.2準確性和精密度用該方法檢測商(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3個濃度的PnPsl標準品，每個濃度幣:復測定5次,連續(xù)檢測3d,計算標準多糖回收率和批內及批間變異系數(shù)。1.10方法應用肺炎球菌I型萌種接種于20mL肺炎球苗培養(yǎng)基,10%CO?培養(yǎng)箱中36Y振蕩培養(yǎng)4ho每30min取樣1次，測定.4頌吸光度，并旦利用建立的夾心ELISA方法測定多糖濃度。2結果2.1兔免疫血清的抗體效價與IgG純度經過6周連續(xù)免疫，采集全血，分離血清.通過雙向免疫擴散法測定血清效價，丹麥血清所標準血清效價為1：4,&

19、gt;成都公司制備的兔免疫血清的抗體效價為1：32；兩者與內部標準PnPsl形成一致的沉淀線，見圖I。利用蛋仃A親和層析純化血清，獲得高純度的抗肺炎多糖1型IgG,經12%還原SDS-PAGE進行分析.可見相對分子質貴分別約為55000的重鏈和23000的輕鏈，見圖2O利用HPLC檢測純度大于90%,見圖3。2.2最佳工作條件及標準曲線的建立最佳工作條件及標準曲線的建立.見參考文獻8,經方陣滴定法稀釋包被抗體與生物素化檢測抗體，結果顯示當包被抗體為0.15jig/mL,生物索化抗體在1:30(XM)(約70.00ng/mL)時信號與背景:依比例最大，見表2c在此條件下，肺炎球留I型多慵在1.5

20、65().(X)ng/mL,線性相關系數(shù)尸為0.98以上，見圖4根據(jù)背景吸光度3倍換算并通過驗證,該方法最低檢測限為3.13ng/mLo表2方陣滴定法確定ELISA最適反應條件Tab.2DeterminationofoptimalconditionforELISAwithacheckboardmethd生物素化抗體稀釋倍數(shù)包被抗體質量濃度(瞄/ml.)抗原(30n"mL)0.050.150.451：30002.3422.3252.362PS11:10(XX)1.8031.9242.013PS11：300001.2821.6431.732PS11：1000000.5820.6320.9

21、32PS11：30000.2550.2850.362PBS1：100000.1340.1420.145PBS1：300000.0640.0680.129PBS1：1000000.0610.0910.125PBS圖4夾心ELISA法測定PSI濃度標準曲線Fig.4ThestandardcurveofthesandwichELISAtodeterminePSIconcentration2.3方法驗證2.3.1特異性驗證在50.00ng/mL肺炎球菌1型標準多糖溶液中混入3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、I9A、I9F、23F共12種其他血清型肺炎球菌多糖(每型終質最濃度50.00n

22、g/mL),測定肺炎球菌1型標準多糖質量濃度為51.26ng/mL,回收率為102%。將50.00ng/mL標準多糖溶解于肺炎肉湯培養(yǎng)基中，計算其回收率為108%,見表3。2.3.2準確性驗證和精密度驗證利用該夾心EUSA法檢測高(50.00ng/mL)、中(12.50ng/mL)、低(3.13ng/mL)3個濃度的PnPsl標準品，每個濃度重復測定5次，其回收率為96%108%,見表4,批內變異系數(shù)小于6.08%；連續(xù)3d檢測上述標準品，批間變異系數(shù)小于7.01%,見表5。表3肉湯培養(yǎng)基中肺炎1型多糖濃度Tab.3TherecoveryratioofPSIconcentrationmixed

23、withbrothmedia加入多耕質量濃度(ng/mL)檢測結果(ng/mL)均值(ng/mL)回收率(%)49.2047.2050.0056.5050.4010848.知50.90表4標準多糖檢測回收率Tab.4TherecoveryratioforstandardPSIPS1標準品質墾均值回收率濃度(ng/mL)(ng/mL)(%)50.0050.43±1.5210112.5012.06±0.67963.133.37±0.06108表5夾心ELISA法測定標準PnPSl精密度驗證結果Tab.5ValidationresultforprecisionofPSI

24、bysandwichELISAPSI標準品批內精密度(n=5)批間精密度質瓦:濃度均值CV%均值(ng/mL)CV%(ng/mL)(ng/mL)50.0050.381.8850.552.8612.5011.066.0811.427.013.133.371.773.335.622.4方法應用將肺炎1型菌種接種于20mL肺炎球菌培養(yǎng)基中，10%C0236T振蕩培養(yǎng)4h,期間每30min取樣1次，測定4頌吸光度，以此判斷細菌生長濃度變化趨勢。同時利用建立的該夾心ELISA方法測定PS1濃度，結果顯示，隨肺炎鏈球菌濃度的增高，多糖質旱濃度增高至2.90瞄/mL,見圖5。3討論肺炎鏈球菌英膜多糖濃度檢測

25、通常使用硫酸慈酮法、硫酸咔喋法等化學方法,該類方法的檢測靈敏度為微克級，并11該類方法對樣品純度要求較高。為了能夠靈敏且特異的檢測出發(fā)酵過程中多糖濃度圖5肺炎1型鏈球菌生長過程中多糖質量濃度變化趨勢Fig.5Thechangetrendoftype1polysaccharidemassconcentrationintheprocessofthegrowthofserotype1streptococcuspneumonia的變化趨勢.為生產工藝的優(yōu)化和穩(wěn)定提供數(shù)據(jù)，研究開發(fā)出夾心ELISA法,與其他夾心ELISA的不同之處在僅需要制備一種動物來源的抗體,從而免去了制備兩種以上動物來源抗體的繁瑣。

26、成都公司細菌性疫苗研究室前期利用全性體免疫家免，所得免疫血清經雙向免疫擴散檢測抗體滴度很低改用新鮮培養(yǎng)的細慎，用沸水火活后，能最大限度保證細I宥莢膜的完整性*。用全菌體混合福氏完全佐劑，進行家兔初次免疫，再用全侑體進行靜脈加強免疫.能明顯提高抗體滴度,雙向免疫擴散檢測達1:320研究將扶得的高滴度兔血清通過親和層析進行純化，拱得了高濃度的抗肺炎多糖IgG抗體。包被該抗體.能有效降低EI.1SA檢測中的非特異性吸附。生物素勺親和素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性研究利用生物素對多糖抗體進行標記,當這種抗體特異識別多糖,并形成抗原抗體發(fā)合物后，生物索再與標記辣根過氧化物的的親和索特異結

27、合。這個信號是多級放大的過程，非常適合檢測培養(yǎng)基中低濃度的多糖含bt,研究顯示最低檢測限為3.13ng/mL,完全滿足生產過程中對低濃度樣品檢測的需要：方法驗i正顯示，即使混入結構相似的其他型別肺炎多械.或倒訥湯培養(yǎng)基中多種成分的干擾，該方法也能特異準確定bt肺炎球保ii型多精。另外對該方法進行批內和批間精密度驗證，結果顯示所有變異系數(shù)均小于15%,證明該方法穩(wěn)定適用，可以用F對*糖生產過程中濃度的質hl:控制將該方法用于實際肺炎球萌發(fā)醉過程檢測，結果顯示,隨者發(fā)酵時間延K,細前濃度逐步增A，其擇放的莢膜多糖也逐漸增多；已經有文獻報道.隨著到達生長平臺期,肺炎球菌釋放自溶酶的活性增強.有更多的

28、英膜多糖被切進入培養(yǎng)基,0：o研究發(fā)現(xiàn).發(fā)酵4h后，細萌濃度達到最高，然后逐漸下降，但.是此時多糖濃度仍繼續(xù)增高，證明r上述觀點。參考文獻HamptonLM,FarlejMMtSchuffiwrVi,Hal.Preventionofanli-Slrqfliatccusimrumimiacwilhconjugatevac-cin<*«J.JounalofInfeclDis.2012.205(3)：40I-4l1.1 MaX.YaoKII,Xie(J.Hal.(«haractenz4ili(>nMrnlhrrHnyrin-rr?*iMantSnyMorocruspf

29、ieunioniaecausinginvasivedi>ra-wminChinrM*childrenJ:.ChinMrdJ(Engl),2013.126(8):1522-1527.13AnsaldiF.IXFlorrnliis1).(umqiaP.Hal.SrnRyiwreplacenwntinStrqacocaASpnmmoniarafter(*<>njiigah*vacciiwintHMluc*tion：im(KU*t.doubtsamiprrspreliu*fornewvac<'in«*sJ.Mirn>lnolt2010.21(3)：56-(4.4L-yvaAtQuintanaAvSinchrzM,rtal.Rapi<lamix-iiMlivran-thnHir-sulfiiric'acidassayininicnqilatcformatto(|uantifycarlxJiy-<lralrinbi(>|)lianna<'riiti