腦鈉肽重組蛋白的表達及生物學(xué)活性的研究.docx

1、腦鈉肽重組蛋白的表達及生物學(xué)活性的研究何濤君I,陸學(xué)東。郭清順2,熊君輝2,李安2,王瓊'(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳市福田人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518033；2.廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建廈門361005)摘要：目的比較腦鈉肽(BNP)連接在不同載體中表達的BNP成熟肽蛋白和BNP前體蛋白的生物學(xué)活性差別.方法采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)定至組質(zhì)粗PGEX-20T-BNP”，PGEX-20T-BNPl0a,B11-BNP和Bl1-BNP皿，分別對其進行PCR、雙酶切和測序鑒定，然后將已測序芟定的包含四種重組質(zhì)檢的工程茵，林化至大防埃希茵B(yǎng)L21茵中表達BNP成熟

2、既蛋白和BNP前體蛋白，并用ELISA法檢洲4種蛋白的生物學(xué)活性作用.結(jié)果在大冊埃希菌中表達的成熟肽安白BNP”和前體蛋白BNPm經(jīng)過純化、復(fù)性后具有生物學(xué)活桂.結(jié)論PGEX-2OT-BNP”4l達的成熟肽安白BNP3l的生物學(xué)活性最強，為下一夕單抗制備的優(yōu)勢蛋白.關(guān)鍵詞：腦鈉肽；成熟肽蛋白BNP32)；前體蛋白(ENP108)中圖分類號:Q784；Q786文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1671-7414(2009)04-027-04doi：10.3969/j.issn.1671-7414.2009.04.012BrainNatriureticPeptideRecombineProteinsExpr

3、essionandActivityResearchmentHETao-junLUXue-dong'GUOQing-shun2,XIONGJun-huiLiAn2,WANGQiong1(1.DepartmentofClinicallaboratoryytheAffiliatedShenzhenFutianHospitaloftheMedicalCollegeofGuangdongGuangdongShenzhen518033;2.NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDiseasesofXiamenU

4、niversity,FujianXiamen361005Abstract：ObjectiveThedifferencebetweenthebiologicalactivityofBNPmaturepolypeptidesanditsprecursorswasexaminedinthispaper.MethodsRecombinantplasmidPGEX-ZOT-BNPj：.PGEX-20T-BNP10«.Bll-BNPJtandBll-BNPigwereconstructedbymolecularbiologicalmethods,whichwereidentifiedbyPCR.

5、restrictionenzymedigestionandsequenceanalysis.Thosefourrecombinantplasmids*identifiedbysequencing,weretransformedintoE.coltBL21andexpressedBNPmaturepolypeptidesandtheircorrespondingprecursors,whosebiologicalactivitywasdeterminedbyE1A.ResultsBNPmaturepolypeptidesBNPi2anditsprecursorBNP10gwhichwereexp

6、ressedincolonbacilluswerereactiveafterpurificationandrenaturation.ConclusionBNPmaturepolypeptideswhichisexpressedbyPGEX-20T-BNP”ismostreactiveandwillbesuperiorforinducingBNP-mAbinnextstep.Keywords：brainnatriureticpeptide(BNP)jmaturepolypeptidesprotein(BNP3l)precursorsprotein(BNPJ0«)1988年,Sudoh和

7、他的同事首次從豪豬腦內(nèi)分離出一種新的肽類物質(zhì)，能引起利鈉和利尿作用并將其命名為“腦利鈉肽”，盡管其被稱為腦利鈉肽(BNP),但是其最主要的合成部位是心室肌，且以左心室合成為主，其分泌主要由左室壁張力進行調(diào)節(jié)，因此BNP反映心室功能改變更敏感、更具特異性'%它和利鈉肽系統(tǒng)的另外兩個重要成員心房利鈉肽(ANP)及C型利鈉肽(CNP)的共同結(jié)構(gòu)特征是都有一個17個氨基酸組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，腦鈉肽(BNP)是繼ANP后利鈉肽系統(tǒng)的又一成員。它們都參與心血管系統(tǒng)的病理生理過程，在調(diào)節(jié)血壓、體液平衡及心血管功能方面起重要作用。腦鈉肽(BNP)是一個有32個氨基酸的多肽化合物，主要由心室分泌其BNP含量

8、且與心室體積和壓力超負(fù)荷呈正比，與左心功能密切相關(guān)“乳BNP的mRNA翻譯出一個含134個氨基酸殘基的BNP前原體(preproBNP),在N端切去26個氨基酸殘基的信號肽后成為含有108個氨基酸殘基的BNP前體(proBNP),無活性的proBNP主要存在于心室肌細(xì)胞中，在蛋白酶的作用下形成1分子有活性的BNP(32個氨基酸殘基)和1分子無活性的含76個氨基酸殘基的片段(aminoterminalproBNP,NT-proBNP)“8。本研究旨在探討含有108個氨基酸殘基的BNP前體和含有32個氨基酸殘基的活性BNP表達的蛋白的生物學(xué)功能的差別。1材料與方法作者簡介：何濤君(1981-),女

9、，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究.通訊作者：陸學(xué)東，E-mail：luxuedonR2004.作者簡介：何濤君(1981-),女，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事分子生物學(xué)方面的研究.通訊作者：陸學(xué)東，E-mail：luxuedonR2004.1.1材料TaqDNA聚合酶，T4連接酶,BamHI,EcoRI限制性內(nèi)切酶,DNAmarkerDL2000均購自大連TaKaRa生物工程公司；PGEX-20T載體、B11載體、BL21菌種由廈門大學(xué)國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心惠贈;10901-HE1AforBNP-32(Human)購自Sigma公司；蛋白分子量Marker購自凱基生物科技發(fā)展公

10、司。1.2方法1.2.1PCR特異性擴增目的BNP前體和活性BNP基因：登錄GcnBank獲得BNP序列，對照PGEX-20T和B11載體上的多克隆博切位點，弓I入BamHI,NdeI和EcoRI酶切位點加上保護性堿基，設(shè)計引物上游引物分別為BNP-32-P1(TTTTGGATCCCATATGCACCGAAAATGGTA),BNP-108-P2(TTTTGGATCCCATATGCACCCGCTGGGTTCT),兩者共同的下游引物BNP-P3(TTTTGAATTCTTAATGGCGACG),PCR特異性擴增出目的基因。反應(yīng)體系為ddl%032.7510Xbuffer51，1。mmol/LdNTP

11、s4卜1,25mmol/LMgCI24pl,UpstreamPrimer(20/xmol/L)1fil,DownstreamPrimer(20ptmol/L)1用,模板2pd,TaKaRaExTaq(5u/ptl)O.25yl,總體積50混勻后短暫離心，先94C預(yù)變性5min后，于94C30s,58C45s,72C1min,共循環(huán)30次，獲得目的基因。1.2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建：將擴增得到的目的基因和PGEX,B11質(zhì)粒分別進行BamHI和EcoRI雙酶切和連接反應(yīng),構(gòu)建重組質(zhì)粒。前切體系(質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物各10pX.BamIII和EcoRI酶各11,Kbuffer2pl,ddH2O6pd,共20

12、)37C水浴1h,65C水浴15min終止酶切反應(yīng)。連接體系(ddH?O8.5pl,10XLigationBuffer2.5pl>PCRproduct6gUPGEX-ZOT/Bl12r1,T4DNALigase1>1,共20m1)16C連接過夜，65C水浴15min終止連接反應(yīng)。1.2.3重組質(zhì)粒雙酶切、PCR及測序鑒定：分別對其進行PCR、雙酶切和送往上海生工測序鑒定。PCR和雙酶切反應(yīng)的體系、條件如前。1.2.4重組蛋白表達SDS-PAGE鑒定:將測序鑒定的工程菌轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21中，在37C,IPTG濃度為1.0mmol/L,誘導(dǎo)3h后均表達了目的蛋白。1.2.5重組蛋白

13、存在狀態(tài)分析:首先在37C條件下，將重組菌培養(yǎng)至A=0.6左右。用1.。mmol/L的IPTG分別在25C誘導(dǎo)重組菌5h,然后收集菌體超聲裂菌。離心分別收集上清和沉淀行SDS-PAGE,分析目的蛋白在超聲裂解的上清還是沉淀中。1. 2.6重組蛋白的純化將包含PGEX-20T-BNP32和PGEX-20T-BNPM8載體的重組菌大量誘導(dǎo)表達后留取上清過帶有GST標(biāo)簽的純化柱，按純化柱的操作說明純化目的蛋白。1. 2.7重組蛋白的溶解與復(fù)性：將包含B11-BNP”和Bll-BNPg載體的重組菌大量誘導(dǎo)表達后收集包涵體，首先用Buffer1(20mmol/LTris-5mol/LNaCl,20mmo

14、l/LED-TA,pH=8.5)4-等體積的4ml/dlTritoninbuffcrl的溶液洗滌包涵體兩遍，離心收集菌體。分別用2,4,8mol/L的尿素溶解包涵體，同時要留取標(biāo)本進行SDS-PAGE,比較目的蛋白在哪個尿素梯度溶解的效果最好。然后采用尿素梯度透析法復(fù)性，使蛋白盡雖恢復(fù)其天然構(gòu)象。1.2.8重組蛋白復(fù)性后的組裝：因目的蛋白具有一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，將復(fù)性后的重組蛋白進行組裝成顆粒，其會具有更強的免疫活性，組裝液(20mmol/LPB6.0+300mmol/LNaCl)。1. 2.9表達的4種重組蛋白的活性檢測：采用ELISA法檢測比較，觀察哪一種蛋白的活性最強。1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用S

15、PSSU.10軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計:&資料用歹士5表示，兩組比較采用t檢驗。2結(jié)果1目的基因的擴增結(jié)果有活性的成熟肽BNP基因(包括兩端的酶切位點和保護性堿基)大小約為122bp,同樣計算BNP前體基因大小約為350bp,見圖1。2345l.DNAMarkerDL20002,3.PCRproductofBNP324,5.PCRproductofBNP1081.DNAMarkerDL2000；2,3.PCRproductofBNP32»4,5PCRproductofBNPjog圖1PCR產(chǎn)物瓊脂粳凝膠電泳分析2.2重組質(zhì)粒的雙酶切及PCR鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒PGEX-20T-BN

16、P32,B11-BNP32,PGEX-20T-BNPn8和B11-BNP睥的雙酶切鑒定結(jié)果均能切出目的條帶，見圖2。2. 3測序鑒定將4種重組質(zhì)粒的測序結(jié)果與GenBank上登錄的BNP序列，在NCBI上做BLAST比對，同源性100%,完全正確，無堿基突變和讀碼框移位。1.PGEX-2OT-BNP32digestedbyBamHI&lEcoRI；2.Bll-BNP”digestedbyBamHi&£coRI(3.PGEX-2OT-BNPio.digestedbyBamHI&EcoRI;4.Bl1-BNPjoedigestedbyBamH1&EcoRI

17、»5.DNAMarkerDL2000圖2重組質(zhì)粒的雙酸切鑒定2.4重組蛋白表達的存在狀態(tài)分析，純化與復(fù)性將重組蛋白未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的同時進行SDS-PAGE,結(jié)果顯示IPTG誘導(dǎo)后均能表達目的蛋白，存在狀態(tài)分析PGEX-20T-BNP”(29.5KDa)和PGEX-20T-BNPm(37.9KDa)表達的重組蛋白存在于超聲裂菌的上清中，而B11-BNP32(19.9KDa)和Bll-BNPm(28.3KDa)表達的重組蛋白存在于超聲裂菌的沉淀中。將PGEX-20T-BNP32和PGEX-2OT-BNP1O8±清表達的蛋白過GST柱純化，把B11-BNP32和B11-BNP1O8

18、以包涵體形式表達的重組蛋白先溶解在尿素中，然后在尿素梯度透析中復(fù)性，見圖3。12345678910supernatantofbrokenbacteriawithPGEX-20T-BNP”1. purificationofsupernatantwithPGEX-20T-BNP,supernatantofbrokenbacteriawithPGEX-20T-BNPIM2. purificationofsupernatantwithPGEX-20T-BNP心precipitationofbrokenbacteriawithBl1-BNP3. precipitationofBl!-BNPin8MUre

19、arcnaturationofBl1-BNP4. precipitationofbrokenbacteriawithB11-BNPIMprecipitationofB11-BNPIMin8MUrea5. renaturationofB11圖3重組蛋白的純化與復(fù)性SDS-PAGE分析2.5優(yōu)勢重組蛋白的選擇將四種純化與復(fù)性后的重組蛋白通過人源性BNP32-ELISA試劑盒檢測，結(jié)果顯示四種重組蛋白都具有生物學(xué)活性，其中以PGEX-20T-BNP32表達的蛋白的活性最強，兩兩之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(PV0.05),見圖4。免疫小白鼠，準(zhǔn)備單抗的制備。圖44種重組狼白的活性檢測3討論BNP血漿濃

20、度與心功能狀態(tài)密切相關(guān),它代表了心臟標(biāo)志物檢測的另外一個完全嶄新的方向。檢測BNP能夠從那些沒有臨床癥狀或臨床癥狀輕微的左心功能不全患者中，鑒別出需要臨床治療的患者，早期干預(yù)其心力衰竭的病理生理進程。正常BNP濃度可以在很大程度上排除心功能受損。但必須注意的是，盡管BNP可以提高心衰的診斷準(zhǔn)確性，但它不是一個獨立的檢查，某些心肺疾病、腎衰、肝硬化等也可使血漿BNP濃度升高。相信隨著研究的深入，BNP濃度很有可能成為評估心功能的一個重要指標(biāo)，成為一項簡便易行的常規(guī)檢查。本研究采用基因工程方法，將目的片段克隆到原核表達載體中從而獲得重組蛋白。原核表達系統(tǒng)表達相對簡單，具有產(chǎn)量高、易操作、穩(wěn)定性好等

21、優(yōu)點。另外，它也是目前人類了解最深入最全面的基因工程表達系統(tǒng)，現(xiàn)在開發(fā)出來的基因工程產(chǎn)品中80%90%采用的是原核表達系統(tǒng),所以我們決定選用原核系統(tǒng)制備BNP蛋白。首先登錄GenBank獲得BNP基因，通過PCR技術(shù)特異性擴增目的片段BNP”BNPm°在目的基因的特異性擴增中，上游引入BsnH1和Nde1兩個魏切位點，主要是為了表達載體的選擇和方便酶切鑒定。然后將其分別定向克隆到PGEX-20T和B11兩個載體上，在大腸埃希菌BL21中表達BNP前體蛋白(BNP)和成熟肽蛋白(BNP108)o對4種蛋白進行相應(yīng)的純化處理，再用BNP試劑盒檢測4種蛋白的活性功能差異，選擇優(yōu)勢蛋白作為抗

22、原免疫小鼠，具有很好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，可以為下一步的腦鈉肽單克隆抗體的制備奠定基礎(chǔ)。目前國內(nèi)檢測BNP均依賴各種國外的試劑盒，診斷標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，價格昂貴，在一定程度上限制了BNP檢測在臨床上的廣泛應(yīng)用。腦鈉肽單克隆抗體的制備將有助于我們開發(fā)國產(chǎn)的BNP檢測試劑盒?？傊?BNP是反映心室功能改變更敏感、更具有特異性的生化指標(biāo)，它在體內(nèi)參與許多疾病的病理過程，因此其對心衰的早期診斷、評估、治療以及心臟疾病緩解過程是非常重要的參考指標(biāo)，在心血管疾病方面有著廣泛的應(yīng)用前景E。參考文獻：1 SudohT,KangwaK,MinaminoN,etal.Anatriureticpeptideinporc

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