轉(zhuǎn)基因防齲生菜葉片轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化.docx

1、轉(zhuǎn)基因防齒禹生菜葉片轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化陳筑瑚，劉建國'，張燕）馬欣榮3,吳家媛'，唐琳二管曉燕'，顧瑜'，白國輝'（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義563000；2.貴陽市口腔醫(yī)院，貴州貴陽550002；3.中國科學(xué)院成都分院生物研究所，四川成都610041）摘要：目的：優(yōu)化生菜的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為下一步防胡用轉(zhuǎn)基因植物表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化生菜工作提供實驗基礎(chǔ)。方法：以6種不同的生菜種子為試材，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)對出芽率比較，苗齡及直接分化培養(yǎng)基的確定以及抗生素敏感性測試，獲得正常再生抗性生菜植株。結(jié)果：34d的“意大利”生菜子葉在1/2MS+0.0

2、5mg/LNAA+0.Img/L6-BA培養(yǎng)基上直接分化率最高，生根培養(yǎng)其為1/2MS,抗生索巴龍霉素（Pan）momycin）選擇壓濃度為50mg/Lo結(jié)論：成功確立了防格用轉(zhuǎn)基因植物表達栽體質(zhì)粒的生菜葉片轉(zhuǎn)化體系，獲得了較高的轉(zhuǎn)化頻率。關(guān)鍵詞：生菜；葉片；植株再生；融病中圖分類號：S636.2文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1001-4705（2012）0830054）5TheOptimalConditionsofTransgeneticSystemofLettuceAgainstDentalCariesCHENZhu'2,LIUJian-guo*,ZHANGYan',MAXin-

3、rong3,WUJia-yan1,TANGLing*,GUANXiao-yan1,GUYu1,BAIGuo-hui1(1.TheAffiliatedStomatologicalHospital,ZunyiMedicalCollege,ZunyiGuizhou563000,China；2.TheStomatologicalHospitalofGuiyang,GuiyangGuizhou550002,China；3.ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,ChengduSichuan610041,Cihna)Abstract:Objec

4、tive:Toobtainoptimalconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichcouldprovidetheconditionforthefurthertransformationstudyoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcaries.Method:Byusingthesixdifferentvarietieslettuceasexplants,thetechnologyofplantregenerationwasstudied.Severalfactorssuchasbudratio,

5、hormoneconcentrationandtheantibioticselectionpressureandsoon,wereinvestigatedtooptimizetheregenerationsysteminvitro.Result:Theexperimentalresultsshowedthatcomparedwithsixdifferentvarietiesoflettuce,Theseedof"YiDali"lettucesproutfastestanditsbudratioisthehighest.Itisshownthatthebestoptimalc

6、onditionsisthatthe3-4dayoldlettuceplantcotyledongrewonthe1/2MS+0.05mg/LNAA+0.1mg/L6-BAmedium；Itwasoptionaltochoice50mg/Lparomomycinastheantibioticselectionpressure.Conclusion:Theconditionsoflettucetransgeneticsystem,whichshouldprovidetotransformationoftransgenicplantexpressionvectoragainstdentalcari

7、es,weresuccessfullyconstructed.Keywords：lettuce；leaf；plantregeneration；dentalcaries收稿日期:2012-05-19項目基金：國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：30160086）；教育部高等學(xué)校特色專業(yè)建設(shè)項目資助（文件號:教高函：200731號）；貴州省高等學(xué)校示范性專業(yè)建設(shè)項目資助（文件號：黔教高發(fā)2008J184號）；貴州省高層次人才科研條件特助經(jīng)費項目（合同號:TZJF-20I1年-30號）。作者簡介:陳筑（1979-）,女，貴州省貴陽市人;博士，主治醫(yī)師，研究方向：胡病的免疫學(xué)防治;E-mail：16058

8、94600。通訊作者：劉建國，博土，教授，主任醫(yī)師;E-mail轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗具有生產(chǎn)成本低、可永久表達外源蛋白質(zhì)、不用冷藏、町直接食用等優(yōu)點，有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物可食疫苗的研究受到高度的重視，該領(lǐng)域的研究進展非常迅速。植物轉(zhuǎn)基因的前提條件是建立高效的植株再生系統(tǒng)。生菜極富營養(yǎng)，含有抗氧化物、F胡蘿卜素及維生素B,工2工6、維生索C和維生素E,它還含有豐富的微景元素和膳食纖維素。最新的研究發(fā)現(xiàn)，球形生菜中含有一種原兒茶酸物質(zhì)，對胰腺癌有明顯的抑制作用。另外，常吃生菜能改善胃腸血液循環(huán)、有效預(yù)防膽石癥和膽囊炎等功效。牛.菜吃法甚多，深受大眾喜愛。轉(zhuǎn)基因植物工程中,生菜遺傳

9、轉(zhuǎn)化研究開展較早，有較好的遺傳轉(zhuǎn)化體系，已成為不錯的生產(chǎn)食用疫苗生物反應(yīng)器1材料與方法11材料1.1.1生萊材料實驗用生菜為美國大速生、意大利生菜、路路通、意大利抗熱耐抽墨生菜、香港玻璃生菜、臺灣玻璃生菜，購至四川省農(nóng)科院種子公司。分別命名為S1、S2、S3、S4、S5和S6。1.1.2質(zhì)粒和菌株轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌為EHA105,分別含植物表達載體質(zhì)粒p2355-gtfB（攜帶選擇標(biāo)記基因為抗性基因npt-D基因及報告基因gus）和p2365-gtfB（攜帶選擇標(biāo)記基因為抗性基因npt-D基因）（本課題組前期構(gòu)建）。12方法1.2.1不同生菜種子出苗率比較生菜種子（S1、S2、S3、S4、S5和S6

10、）用3%4%次氯酸鈉水溶液振蕩滅菌15min后，以無菌水清洗3次，播種于1/2MS培養(yǎng)基上，每個三角瓶15粒，光照16h/d,25X.條件F誘導(dǎo)發(fā)芽。14d后統(tǒng)計各生菜種子的出苗率，選擇發(fā)苗率最高的一種生菜苗進行下一步實驗。1.2.2苗齡及直接分化培養(yǎng)基的確定取苗齡為34d、710d的生菜子葉橫向切片去除端部，每葉24片，置于FlF8培養(yǎng)基E,每皿10個。25丁，16h/d光周期條件下誘導(dǎo)不定芽形成。1個月后統(tǒng)計不定芽發(fā)生的外植體頻率。1.2.3 抗生素敏感性測試根據(jù)離體培養(yǎng)結(jié)果，篩選出適宜的選擇再生培養(yǎng)基F1及34dS2生菜子葉，用F1附加抗生素進行抗生素敏感性測試。將S2外植體置于附加（0

11、、10、15、25、5O、75、1OOmg/L）的卡那霉素F1培養(yǎng)基上。另取一部分子葉接種于附加（。、25、50.75mg/L）的巴龍霉素F1培養(yǎng)基上，分別進行卡那霉素、巴龍霉素的敏感性測定，培養(yǎng)條件同上，定期記錄分化情況。1.2.4 菌株培養(yǎng)將-70勾保存的含有植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌陽種EHA105接種于3mL含Km（100陌mL）和利福平（100妃mL）的I.B液體培養(yǎng)基中,28X.200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，使0D處值為0.60.8。按1%2%的比例轉(zhuǎn)入新配制的無抗生素的1/2MS液體培養(yǎng)基中，同時加入100mol/L的AS。在與上相同的培舞條件卜培養(yǎng)6h左右,01）如值約為0.5時

12、即可。1.2.5轉(zhuǎn)化及篩選于無菌操作臺將34d苗齡的生菜子葉,放入浸染液中浸染15min后取出，葉背向下置于共培養(yǎng)基中,25Y暗光培養(yǎng)2d后,將切片轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，25Y培養(yǎng)，每皿10個外植體,14d繼代1次。1.2.6生根及移載將長出的不定芽轉(zhuǎn)入加巴龍霉素50mg/L,特美汀100mg/L的1/2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。生根后開瓶鍛煉，移入土中。2結(jié)果2.1生菜發(fā)芽率的比較實驗比較（S1、S2、S3、S4、S5和S6）6種生菜材料,意大利生菜（S2）種子在1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽最快、出芽率最高,差異有統(tǒng)汁學(xué)意義（p<0.05）（見表1）。表1生菜發(fā)芽率的比較品種編號成熟種子出芽數(shù)出芽（

13、%）美國大速生S11005353意大利生菜S21008383路路通S31007070意大利抗熱耐抽苔生菜S41005757否港玻璃生菜S51006565臺灣玻璃生菜S6100676710.0500.1347-105050增長再生最好增K再生較好403020.050.23-450大部分褐化177-1050無再生芽030.100.13450大部分禍化)97-1050大部分?；?40.!0.23450無再生芽071050無再生芽0500.50.053-450無再生芽071050無再生芽060.50.13-450無何生芽071050無再生芽0701.00.053-450生長緩慢2571050無再生芽0

14、81.00.13450生長緩慢1771050無再生芽010.0500.1347-105050增長再生最好增K再生較好403020.050.23-450大部分褐化177-1050無再生芽030.100.13450大部分禍化)97-1050大部分?；?40.!0.23450無再生芽071050無再生芽0500.50.053-450無再生芽071050無再生芽060.50.13-450無何生芽071050無再生芽0701.00.053-450生長緩慢2571050無再生芽081.00.13450生長緩慢1771050無再生芽0激素水苗齡外植體數(shù)應(yīng)止牯冷直接分化率NAAIAA6-BA（d）（個）珈（%

15、）不同激素濃度對不同苗齡生菜葉片外植體芽分化的影響2.2苗齡及直接分化培養(yǎng)基的確定在1/2MS培葬基中加入不同的激素.配制成多種培養(yǎng)基，對苗齡為34d、710d的生菜子葉葉片進行研究，篩選分化效果好的培養(yǎng)基。不同濃度組合對生菜再生影響結(jié)果見表2。S2生菜子葉接種57d后，各培養(yǎng)基中絕大部分生菜子葉邊緣或基端切口處開始有愈傷產(chǎn)生JOd左右，在部分培養(yǎng)基中愈傷組織大代增生，部分培養(yǎng)基中愈傷組織不繼續(xù)再生而分化出綠芽,通過對不同苗齡的生菜在兒種不同培養(yǎng)基中分化情況的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)34d的S2生菜子葉在F1培芥基中培養(yǎng)710d后,部分子葉從切口直接形成綠色小芽,宜接分化率為40%。其余培養(yǎng)基直接分化率較低

16、，且外植體在7d后容易出現(xiàn)褐化死亡。2.3抗生素敏感性洲試生菜在對卡那毒素及巴龍得素的敏感性魂I定中發(fā)現(xiàn),在使用Km時生菜白化苗現(xiàn)象較高，而用巴龍霉素沒有發(fā)現(xiàn)白化茴.確定選擇50mg/L巴龍霉素作為抗生素進行轉(zhuǎn)基因生菜的篩選。2.3.1卡那霉素敏感性測定表3Km敏感性實驗Km濃度（mj/L）01015255075100外植體數(shù)(塊)50505050505050代接分化率(%)401062000生根及植株情況好較好少數(shù)出現(xiàn)白化苗生長緩慢無無無A：4dA右生菜外植體在分化培養(yǎng)米上周圍少量愈傷生成;B：714d生菜外植體愈傷姐熾芽分化;C：4抗徑生菜在生根培養(yǎng)房中長根；D：檢證攜0的獲因的轉(zhuǎn)基因生菜

17、移枝至土墳中栽培圖1生菜轉(zhuǎn)化將苗齡為34d的生菜子葉置于附加不同濃度Km的F1培養(yǎng)基上，可見Km為0時愈傷組織正常產(chǎn)生并分化或直接從切口處出芽、生根，植株正常生長;附加Km后所有培養(yǎng)的子葉均無愈傷組織產(chǎn)生，含10、15.25mg/LKm的培養(yǎng)基中少數(shù)子葉產(chǎn)生生長緩慢并逐漸白化的小芽或直接產(chǎn)生白化芽、芽分化及根生長率明顯降低。子葉及植株在含50mg/L以上的Km分化培養(yǎng)基中黃化逐漸死亡。統(tǒng)計結(jié)果分析顯示，50mg/LKm作為選擇壓力較好(見表3)。2.3.2巴龍霉素敏感性測定將34d的生菜子葉置于附加不同濃度巴龍篝素的F1培養(yǎng)基上，可見巴龍霉素為0時愈傷組織正常產(chǎn)生并分化或直接從切口處出芽，生根

18、及植株并正常生長;附加巴龍霉素后所有培養(yǎng)的子葉均無愈傷組織產(chǎn)生，含10、15、25mg/L巴龍霉素的培養(yǎng)基中，芽分化及根生長率明顯降低。子葉及植株在含50mg/L以上的巴龍霉素分化培養(yǎng)基中黃化逐漸死亡。50mg/L巴龍霉素作為選擇壓力較好(見表4)°表4巴龍霉素敏感性實驗巴龍濃度(mg/L)01015255075100外植體數(shù)(塊)50505050505050真接分化率(%)401351000生根及植株情況好較好緩慢生長緩慢生長無無無2.4轉(zhuǎn)基因生菜抗性植株的獲得通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法分別將植物表達質(zhì)粒p2355-gtfB、p2365-gtfB轉(zhuǎn)化生菜。浸染的生菜子葉葉盤在誘芽篩選培

19、養(yǎng)基(MS+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+50mg/L巴龍+100mg/LTim)培養(yǎng)14d左右即可誘導(dǎo)出芽,將長至11.5cm的芽切下，插入1/2MS+50mg/L巴龍+100mg/LTim的生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根，生根者為抗性植株，轉(zhuǎn)移至土壤種植。本實驗共得到抗性生菜129株,攜帶表達質(zhì)粒P2355-gtfB75株,攜帶表達質(zhì)粒p2365-gtffi64株，經(jīng)觀察攜帶P2365-gtfB的生菜植株普遍比攜帶p2355-gtfB健壯(見圖1)。3討論3.1植物受體的選擇目前,轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究報道主要集中在煙草、馬鈴薯、擬南芥等模式植物上，如在煙草中表達鏈球圜屬突變株表面蛋白

20、、乙肝表面抗原、大腸桿菌熱敏腸毒素B亞基表面蛋白、人類細胞巨化病毒表面蛋白，在馬鈴薯中表達霍亂病毒表面蛋白、諾沃克病毒表面蛋白和細菌性腹瀉抗原，以及用擬南芥生產(chǎn)口蹄疫抗原等，但這些植物都不適合生產(chǎn)可食用的口服疫苗。生菜為菊科茵苣屆植物,是一種由國外引進的生食蔬菜,具有較高的營養(yǎng)價值，生長周期短，整株可以生食,再生和轉(zhuǎn)化率較高，是一種用來表達外源蛋白的良好宿主植物。因此，本實驗選用生菜作為轉(zhuǎn)化受體植物，期望得到可生食的轉(zhuǎn)基因生菜植株，為后續(xù)的動物實驗和一系列免疫實驗研究提供依據(jù)C3.2生菜的高頻率再生系統(tǒng)3.2.1 外植體的選擇外植體的選擇是建立再生系統(tǒng)的第一環(huán)節(jié)。作為轉(zhuǎn)基因植物外植體材料已經(jīng)研

21、究得非常廣泛，涉及到植物的各個組織、器官和部位，不同外植體的脫分化和再生能力、細胞全能性潛在趨勢及感受態(tài)程度等都有很大差異。本實驗通過對不同生菜子葉為外植體建立離體培養(yǎng)再生系統(tǒng)的過程中發(fā)現(xiàn)，不同品種的生菜外植體之間的分化能力差別很大，在6個品種中，意大利生菜子葉具有增殖及再生能力強,且穩(wěn)定性好的特點。已有學(xué)者報道，以生菜子葉為外植體的成功轉(zhuǎn)化能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生相應(yīng)的抗體SE。本實驗通過對34d、710d的意大利生菜子葉的直接分化率比較發(fā)現(xiàn)，34d的生菜子葉獲得的不定芽明顯高于710d的生菜子葉。3.2.2 直接分化培養(yǎng)基的確定設(shè)計出適宜的培養(yǎng)基是建立好的再生系統(tǒng)的一項重要工作，也是進行基因轉(zhuǎn)化研究

22、的先決條件。直接分化再生系統(tǒng)具有操作簡單、方便、獲得植株周期短、能較好保持植物穩(wěn)定性、實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳的優(yōu)點。劉凡等研究表明，生菜大湖366以采用MS+(0.5mg/L)6-BA+0.1mg/LNAA的誘芽培養(yǎng)基為宜;趙吉強等對生菜的研究認(rèn)為.MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)NAA的誘芽培養(yǎng)基對芽的誘導(dǎo)率最高。而左曉峰質(zhì)選用MS+(0.1mg/L)6-BA+(1.0mg/L)IAA誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得了轉(zhuǎn)基因生菜。本實驗通過對NAAJAA分別與6-BA的不同激素的組合獲得了芽的分化，得到了再生植株，結(jié)果表明，誘芽培養(yǎng)基以1/2MS+(0.1mg/L)6-BA+(0.05mg/L)N

23、AA獲得的不定芽分化率最高。3.2.3抗生素的選擇植物基因轉(zhuǎn)化中最廣泛應(yīng)用的選擇標(biāo)記是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptU)，它編碼的產(chǎn)物對某些氨基葡糖昔類抗生素如抗巴龍霉素、G418、新霉素、卡那霉素等反應(yīng)敏感。如果抗生素對植物細胞毒性太大，在短期內(nèi)很快殺死植物細胞，造成轉(zhuǎn)化細胞難以存活，因此選擇既能有效地抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長，又不影響轉(zhuǎn)化細胞正常生長的抗生索及其濃度至關(guān)重要。本實驗早期我們選用卡那霉素作為選擇劑，發(fā)現(xiàn)選擇壓力在50mg/LKm時不定芽在生長過程中逐漸變?yōu)榘谆?沒能獲得轉(zhuǎn)基因苗。后來改用濃度為50mg/L的巴龍霉素篩選,獲得的抗性植株經(jīng)驗證大多數(shù)為含目的基因的轉(zhuǎn)基因材料，效果極佳

24、。3.3關(guān)于選擇標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因植株的影響在基因轉(zhuǎn)化過程中，當(dāng)篩選到轉(zhuǎn)基因植株后，標(biāo)記基因的存在不僅影響目的基因的穩(wěn)定，而LL會加重植物細胞代謝的負擔(dān)。此外，標(biāo)記基因的安全性問題也是值得考慮的問題：“皿，所以去除標(biāo)記基因有利于外源基因的穩(wěn)定表達。本實驗構(gòu)建了攜帶。-葡萄糖昔酸酶基因(gusA)的植物表達質(zhì)粒p2355-gtfB和在其基礎(chǔ)上去掉gusA基因的植物表達質(zhì)粒P2365-gtlB,通過對轉(zhuǎn)基因生菜的觀察發(fā)現(xiàn)不含gusA基因的轉(zhuǎn)基因生菜普遍生長較含gusA基因的轉(zhuǎn)基因生菜健壯，旦部分GUS染色陰性的生菜植株也能擴增出gtfB部分目的片段，提示標(biāo)記基因的存在可能對轉(zhuǎn)基因生菜的生長及表達特性

25、有影響，標(biāo)記基因?qū)D(zhuǎn)基因生菜中GTF-1的表達及對轉(zhuǎn)基因生菜的遺傳穩(wěn)定性和安全性的影響有待進一步研究。參考文獻：1GiddingsG,AllisonG,BrooksD,etal.TransgenicplantsasfactoriesforbiopharmacculicalsJ.NatBiotechnol,2000,18(11):1151-1155.i2KanagarajAndersonPaul,VermaDheeraj,DaniellHenry.Expressionofdengue-3premembraneandenvelopepolyproteininlettucechloroplasts.

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27、interactionofNucleolus,gliadinanddiseaseresistanceinaTriticurnAcsli-vuni-SccaleAfricanumamphiploidfJ.JournalofSichuanAgri-cuhureCniversity,2(X)1,19(4)：34O-343.'4KorzunV,Malyshev8,VoylokovAV,etal.Ageneticmapofrye(SecalecerealeL.combiningRELP,isozyme,protein,mic-njsatelliteandgeneloci：J!,ITieorApp

28、iGenet,2001(102):709-717.5物向暉，吳穎欣，林順權(quán).6種枇杷屬植物花粉形態(tài)掃描電鏡觀察J.果樹學(xué)報.2009.26(4):572-576.ZILIANJOURNALOFINFECTIOUSDISEASES,2008,12(6)：469-471.k4HuyNguyen-Xuan,KimYoungSook.JunSang-Chel,etal.ProductionofaHeat-labileEnterotoxinBSubunit-porcineEpidemicDiarrheaVirus-neutralizingEpitopeFusionProteininTransgenicLettuce(Laclucasativa).BIOTECHNOLOGYANDBIOPROCESSENGINEERING,2009,24(6)：731-737.5唐琳，劉建國，馬欣榮.兩種滅菌方法對番茄種子滅菌效果的評價J.種子,2008；27(9)：17-186PniewskiTomasz,KapustaJozef,BociagPiolr,etal.Low-doseoralimmunizationwithlyophilizedtissueofherbicide-resistantlettuceexpressinghepatitisBsurfaceantigenforpro