西華師范大學(xué)生命科學(xué)院

1、西華師范大學(xué)生命科學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱王祖秀20072一 教學(xué)目的與要求 遺傳學(xué)為生物學(xué)各專業(yè)的必修基礎(chǔ)課之一。 本課程主要通過動(dòng)物、植物、微生物為材料，從個(gè)體、細(xì)胞、分子水平揭示遺傳學(xué)的基本現(xiàn)象與規(guī)律。通過遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，使學(xué)生加深對(duì)遺傳學(xué)基本原理的理解。同時(shí)使學(xué)生熟練掌握經(jīng)典遺傳學(xué)的研究方法與技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握部分現(xiàn)代遺傳學(xué)的實(shí)驗(yàn)操作與技能，熟悉遺傳學(xué)的分析方法，培養(yǎng)學(xué)生分析問題的能力。 本實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容主要包括驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)和綜合性實(shí)驗(yàn)。全部實(shí)驗(yàn)均在教師指導(dǎo)下，由學(xué)生自己動(dòng)手完成。顯微鏡觀察內(nèi)容，均采用顯微鏡示范和顯微圖片示范相結(jié)合的方式。使學(xué)生能高效、準(zhǔn)確地識(shí)別觀察內(nèi)容。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不成功的學(xué)生，要

2、求分析其原因。二 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)及學(xué)時(shí)分配(實(shí)驗(yàn)總學(xué)時(shí)34)實(shí) 驗(yàn) 名 稱學(xué)時(shí)數(shù)實(shí)驗(yàn)一植物有絲分裂的制片與觀察2實(shí)驗(yàn)二人體染色體核型分析及輻射誘變?nèi)旧w畸變的觀察2實(shí)驗(yàn)三大蔥減數(shù)分裂的制片與觀察3實(shí)驗(yàn)四果蠅形態(tài)、性狀、性別、生活史的觀察及雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù) 2實(shí)驗(yàn)五果蠅唾腺染色體制片與觀察3實(shí)驗(yàn)六小鼠骨髓細(xì)胞染色體制片與觀察 4實(shí)驗(yàn)七動(dòng)物染色體分帶技術(shù)3實(shí)驗(yàn)八植物基因組DNA的提?。▌?chuàng)新實(shí)驗(yàn)）4實(shí)驗(yàn)九DNA的凝膠電泳（創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)）4實(shí)驗(yàn)十隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）技術(shù)（創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)）5實(shí)驗(yàn)十一人群中P.T.C味盲及ABO血型基因頻率的分析2 三 教學(xué)內(nèi)容 實(shí)驗(yàn)一 植物有絲分裂的制片與觀察(一) 實(shí)驗(yàn)原理

3、在各種生長(zhǎng)旺盛的植物組織中，包括：孢原組織、根尖、莖尖以及愈傷組織、分化的小孢子、萌發(fā)的花粉管，常進(jìn)行著細(xì)胞分裂。經(jīng)過適當(dāng)?shù)娜〔奶幚?，加以固定、離析、染色、涂抹壓片，可以迅速的將細(xì)胞分散附著在載玻片與蓋片之間。然后進(jìn)行有絲分裂過程中染色體動(dòng)態(tài)變化的觀察。遺傳學(xué)上，通過細(xì)胞有絲分裂的觀察研究染色體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和計(jì)數(shù)，是進(jìn)行核型分析、鑒別雜種等常駐機(jī)構(gòu)用的基本方法。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1觀察染色體在有絲分裂中的動(dòng)態(tài)變化過程，識(shí)別有絲分裂各個(gè)時(shí)期特點(diǎn)，加深對(duì)有絲分裂遺傳學(xué)意義的理解。 2 學(xué)習(xí)和掌握對(duì)植物組織、細(xì)胞的固定、離析和觀察植物根尖有絲分裂的壓片方法。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 蠶豆(四) 實(shí)驗(yàn)器具與試

4、劑 1 器具 恒溫水浴箱、顯微鏡、載玻片、蓋玻片、50ml燒杯、鑷子、刀片、鉛筆、吸水紙、擦鏡紙 2 試劑 95%乙醇、冰醋酸、1NHCl、改良苯酚品紅(五) 實(shí)驗(yàn)步驟 1 取材 用刀片切取0.51.0cm的蠶豆側(cè)根根尖; 2 固定 取下的根尖用3:1的乙醇冰醋酸卡諾氏固定液固定30分鐘; 3 解離 酸解法1) 將材料水洗吸干后,放入60的1NHCl中解離8分鐘,用水充分漂洗后制片。解離的目的是軟化細(xì)胞,使細(xì)胞便于分散。 酸解法2） 將材料放入95%乙醇：濃HCl= 1：1的解離液中在室溫下解離8分鐘, 用水充分漂洗后制片。 4 染色壓片 將漂洗后的根尖置于載片中央，用刀片切取分生區(qū)細(xì)胞少許，

5、滴上一滴染液，蓋上蓋片，染色1015分鐘。用鉛筆頭輕輕敲打蓋片，使細(xì)胞分散。 （六） 觀察與繪制有絲分裂各時(shí)期圖實(shí)驗(yàn)二 人體染色體核型分析(一) 實(shí)驗(yàn)原理 任何一種生物的細(xì)胞都有一定數(shù)目、一定大小和形態(tài)的染色體，便構(gòu)成了生物體特有的核型。核型是指染色體組在有絲分裂中期的表型。包括染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)的總和。不同的生物，其核型是不同的。核型分析是在對(duì)有絲分裂中期染色體進(jìn)行測(cè)量、計(jì)算的基礎(chǔ)上，進(jìn)行配對(duì)，按一定原則編號(hào)（從大到?。?、分組、排列，并進(jìn)行形態(tài)分析的過程。核型分析可以為細(xì)胞遺傳分類、物種間親緣的關(guān)系、以及染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的研究提供重要依據(jù)。因此，在細(xì)胞遺傳研究領(lǐng)域中具有重要意義。

6、(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解核型分析的過程，學(xué)習(xí)核型分析的方法。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 正常男人、正常女人的染色體照片(四) 實(shí)驗(yàn)器具 毫米尺、計(jì)算器、剪刀、鑷子、膠水（制作染色體標(biāo)本片的器具見人體外周血培養(yǎng)技術(shù)，攝影顯微鏡、放大機(jī)、相紙、暗室設(shè)備等。）（五） 實(shí)驗(yàn)步驟1 正常男人、正常女人的染色體標(biāo)本片顯微觀察選染色體形態(tài)好、分散好、且完整的細(xì)胞進(jìn)行顯微攝影沖洗膠卷放大成照片（教師準(zhǔn)備）2 對(duì)照片上分散的染色體隨機(jī)編號(hào)，測(cè)量、記錄每條染色體的長(zhǎng)臂、短臂、臂比、全長(zhǎng)和相對(duì)長(zhǎng)度。相對(duì)長(zhǎng)度=每條染色體的長(zhǎng)度/單倍染色體組長(zhǎng)度（2n總長(zhǎng)度/2）X100臂比=長(zhǎng)臂長(zhǎng)度/短臂長(zhǎng)度（q/p）3 配對(duì) 根據(jù)測(cè)定的每條染

7、色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比，將大小和形態(tài)相近的兩條染色體配對(duì)成一對(duì)同源染色體。4 分類和排序染色體的分類根據(jù)Levan（1964）的分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)臂比大小不同分成：m、sm、st、t四類。根據(jù)相對(duì)長(zhǎng)度的大小，將配對(duì)后的染色體從大到小編號(hào)排序。附人類正常男人的核型圖:人體染色體核型分析數(shù)據(jù)表染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度長(zhǎng)臂短臂臂比染色體類型染色體編號(hào)相對(duì)長(zhǎng)度長(zhǎng)臂短臂臂比染色體類型113214315416517618719820921102211X12Y實(shí)驗(yàn)三 大蔥減數(shù)分裂的制片與觀察 (一) 實(shí)驗(yàn)原理 進(jìn)行有性繁殖的生物,都要通過減數(shù)分裂形成配子。減數(shù)分裂過程中，染色體復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次。因此，通過減數(shù)

8、分裂形成的配子中的染色體數(shù)目減半。由2N變成N。減數(shù)分裂過程中，染色體要發(fā)生一系列的變化。在適當(dāng)時(shí)機(jī)采集植物花蕾，經(jīng)固定后，取花蕾中的花藥制片，就可在顯微鏡下觀察到染色體在減數(shù)分裂中的行為和變化過程。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 觀察染色體在減數(shù)分裂中的行為和變化過程，識(shí)別減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期特點(diǎn)，加深對(duì)減數(shù)分裂遺傳學(xué)意義的理解； 2 掌握觀察植物減數(shù)分裂的制片技術(shù)。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 大蔥花序(四) 實(shí)驗(yàn)器具與試劑 1 器具 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、吸水紙、擦鏡紙 2 試劑 95%乙醇、冰醋酸、改良苯酚品紅(五) 實(shí)驗(yàn)步驟 1 取材：在2-3月份，摘取1.52.0cm大小的大蔥花序;2 固定

9、: 取下大蔥花序用3:1的乙醇冰醋酸卡諾氏固定液固定24小時(shí)后轉(zhuǎn)入70%的酒精中保存.3 制片: 取大小適當(dāng)?shù)幕ɡ?用解剖針剝出花藥,將花藥置于載片中央,滴上一滴染液,用鑷子挾破花藥,擠出花粉母細(xì)胞，除去大塊雜質(zhì)，蓋上蓋片。(六) 觀察并繪制大蔥減數(shù)分裂各時(shí)期細(xì)胞圖實(shí)驗(yàn)四 果蠅形態(tài)、性狀、性別、生活史的觀察及雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)(一) 實(shí)驗(yàn)原理 果蠅是雙翅目昆蟲,它具有生活周期短（25培養(yǎng)，兩周一個(gè)世代，）；繁殖力強(qiáng)（每只雌果蠅一生中可產(chǎn)400只卵）、數(shù)量大；個(gè)體小、易培養(yǎng)；可見形態(tài)突變性狀多等優(yōu)點(diǎn)，因此，果蠅是用作遺傳實(shí)驗(yàn)極好的材料。后來還發(fā)現(xiàn)果蠅不僅染色體數(shù)目少，2N=8，還具有巨型的唾腺染色體，

10、是進(jìn)行細(xì)胞遺傳研究的極好材料。因此，對(duì)果蠅形態(tài)及生活史的了解具有重要意義。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1觀察果蠅生活史中各個(gè)階段形態(tài)特征,掌握果蠅培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的制備； 2 正確區(qū)分果蠅雌雄和幾種常見的突變性狀； 3 掌握觀察果蠅性狀的麻醉技術(shù);4 進(jìn)行果蠅雜交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 5個(gè)果蠅品種(四) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1 觀察果蠅生活史： 全變態(tài)昆蟲： 卵 幼蟲 蛹 成蟲 培養(yǎng)溫度對(duì)生活周期長(zhǎng)短的影響 培養(yǎng)溫度 10 15 20 25 卵 幼蟲： 8天 5天 幼蟲成蟲： 57天 18天 6天 4天 2 雌雄性別的鑒別區(qū)別雌性雄性1）體大體小；2）腹部橢圓、末端稍尖；腹部末端鈍圓；3）成

11、蟲腹部背面有5條黑色細(xì)條紋；成蟲腹部背面有2細(xì)1粗的3黑條紋；4）腹部腹面有6個(gè)腹片腹部腹面有4個(gè)腹片5）第一對(duì)胸足附節(jié)基部無性梳第一對(duì)胸足附節(jié)基部有性梳6）肛上板簡(jiǎn)單（白色）肛上板復(fù)雜（褐色） 附: 野生型果蠅圖 雄性() 雌性()3 常見的幾種突變性狀 野生型： 長(zhǎng)翅（+） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（+） 殘 翅： 殘翅（vg） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（+）黑檀身： 長(zhǎng)翅（+） 紅眼（+） 直剛毛（+） 灰身（e）白 眼： 長(zhǎng)翅（+） 白眼（w） 直剛毛（+） 灰身（+） 三隱性： 小翅（m） 白眼（w） 焦剛毛（sn） 灰身（+）4 果蠅麻醉技術(shù):（深麻與淺麻）5 果蠅培養(yǎng)

12、基的制備 玉米培養(yǎng)基配方水瓊脂蔗糖玉米粉酵母汁丙酸75ml1.5g13.5g10g1勺0.5ml6 果蠅雜交實(shí)驗(yàn)步驟 1）選雜交用的親本果蠅：用作母本的雌果蠅一定要是處女蠅； 2）在25培養(yǎng)7天后，倒去親本果蠅，等待F1的羽化； 3）培養(yǎng)14天，觀察記錄F1果蠅的性狀，制備新培基，將F1轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中，讓其自交； 4）實(shí)驗(yàn)第21天，倒掉F1，等待F2果蠅的羽化； 5）實(shí)驗(yàn)第28天，觀測(cè)統(tǒng)計(jì)F2的類型和數(shù)目,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行c2檢驗(yàn), 判斷結(jié)果是否符合遺傳規(guī)律。實(shí)驗(yàn)五 果蠅唾腺染色體的制片與觀察(一) 實(shí)驗(yàn)原理 唾腺染色體是存在于雙翅目昆蟲唾腺細(xì)胞內(nèi)的一種巨型染色體。它是DNA經(jīng)多次復(fù)制（500-

13、1000）而不分開所形成的。因此，又叫多線染色體。它在細(xì)胞學(xué)上有四大特點(diǎn)：1 大；2 同源染色體緊密配對(duì)；3 具有染色中心；4 具著色深淺不同、寬窄不同的橫紋。四對(duì)染色體共有5000多條帶紋。每條染色體的橫紋是恒定的，是識(shí)別染色體的重要標(biāo)記，是進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)研究的極好材料。染色體的四在結(jié)構(gòu)變異都是通過唾腺染色體發(fā)現(xiàn)的。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 學(xué)習(xí)觀察唾腺染色體的制片方法；2 觀察唾腺染色體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中的重要意義。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 果蠅三齡幼蟲（培養(yǎng)基中多放酵母，在17-20培養(yǎng)）(四) 實(shí)驗(yàn)器具與試劑 1 實(shí)驗(yàn)器具 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、解剖針、吸水紙、擦鏡紙。 2 試劑 甘

14、油蛋白、0.7%生理鹽水、1N HCl、蒸餾水、苯酚品紅（P208）、無水乙醇、Eupara（牛派膠）(五) 實(shí)驗(yàn)步驟 1 滴甘油蛋白涂片； 2 取唾腺：選一條大且活動(dòng)的三齡幼蟲于載片的中央，滴一滴生理鹽水，兩手條握一枚解剖針，一枚按住幼蟲前1/3處固定不動(dòng)，一枚按住幼蟲頭部用力向前拉，唾腺隨之而出。然后根據(jù)半透明、囊狀認(rèn)識(shí)唾腺，除去雜質(zhì)。3 1NHCL處理唾腺2-3分鐘（使組織松散,便于壓片）后,用蒸餾水沖洗兩次；4 用苯酚品紅染色10-15分鐘；5 壓片：垂直用力，切勿搓動(dòng)蓋片；(六) 鏡檢觀察并繪制唾腺染色體圖（附果蠅唾腺染色體）實(shí)驗(yàn)六 小鼠骨髓細(xì)胞染色體制片與觀測(cè)(一) 實(shí)驗(yàn)原理 在骨

15、髓細(xì)胞中，有絲分裂的指數(shù)是很高的。因此，可以直接得到中期細(xì)胞而不必像淋巴細(xì)胞或其它組織細(xì)胞那樣經(jīng)過無菌培養(yǎng)。主要的中期相來自成紅細(xì)胞，也來自自各種骨髓母細(xì)胞。通過骨髓得到染色體無需無菌操作。采用直接法從骨髓中取出細(xì)胞，經(jīng)滴片、空氣干燥，可以得到較好的染色體標(biāo)本片，供細(xì)胞遺傳分析用。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1 學(xué)習(xí)用骨髓細(xì)胞制備動(dòng)物染色體標(biāo)本片； 2 觀察小鼠染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和雌雄間的染色體差異(三) 實(shí)驗(yàn)材料 65-90天齡的年青小白鼠(四) 實(shí)驗(yàn)器具與試劑 1 器具 2ml注射器、5號(hào)針頭、5ml離心管、吸管、試管架、載片、離心機(jī)、顯微鏡、剪刀、鑷子、量筒、燒杯2 試劑 100微克/ml的秋水仙素

16、液、2%檸檬酸鈉、0.075KCl、冰醋酸、甲醇、Giemsa原液、0.01M磷酸緩沖液(PH6.8)(五) 實(shí)驗(yàn)步驟 1 秋水仙素處理：取骨髓前4小時(shí)先給小鼠經(jīng)腹腔注射秋水仙素0.8ml。2 取骨髓：用斷髓法迅速處死小鼠，用解剖剪剪掉大腿上的皮膚和肌肉，取出完整股骨，用2%檸檬酸鈉洗干凈，剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭，露出骨髓腔。用吸有適量檸檬酸鈉液的注射器從股骨的一端插入注射針頭，將骨髓吹入離心管，反復(fù)吹洗數(shù)次，直至股骨變白為止。離心管中的細(xì)胞懸液可達(dá)4.5ml。3 低滲處理 將所獲細(xì)胞懸液經(jīng)1000rpm離心10分鐘,吸去上清液,加入0.075MKCl 4.5ml, 立即將細(xì)胞團(tuán)吹散打勻,在

17、室溫下靜止25分鐘。 4 固定 低滲處理后的細(xì)胞經(jīng)1000rpm離心10分鐘，吸去上清液，沿管壁加4.5ml 3:1的甲醇冰醋酸固定液,立即吹散細(xì)胞團(tuán),使其在固定液中懸浮均勻。靜止固定30分鐘后離心,去上清液,重復(fù)固定一次。當(dāng)?shù)诙喂潭ê箅x心,去上清液,再加入1:1甲醇冰醋酸固定液進(jìn)行第三次固定,20分鐘后,離心去上清液,然后加入1:1甲醇冰醋酸2-3滴,搖勻制成細(xì)胞懸液.5 滴片 取事先在冰水中預(yù)冷的載片,滴一滴細(xì)胞懸液于粘有冰水的載片上,立即吹散細(xì)胞,將染色體裝片自然干燥.6 染色 將染色體裝片反扣在染色板上,用5%Giemsa染色液進(jìn)行扣染20分鐘,(六) 觀察小鼠染色體的特征,并繪制染

18、色體圖 附小鼠染色體圖片 小鼠染色體實(shí)驗(yàn)七 動(dòng)物染色體分化染色技術(shù)(C-帶)(一) 實(shí)驗(yàn)原理 C-帶是最簡(jiǎn)單的一種帶。70年代用原位雜交的方法證明,C-帶區(qū)是結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)。染色體標(biāo)本經(jīng)酸處理,使DNA脫嘌呤。堿處理產(chǎn)生一個(gè)高水平的DNA變性，促進(jìn)DNA溶解。用2XSSC鹽溶液處理使DNA骨架斷裂并使斷片溶解。而異染色質(zhì)區(qū)DNA對(duì)抽提有較大的抗性，保留了部分DNA，用Giemsa染色出現(xiàn)深染帶。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)C-帶分帶技術(shù)和顯帶原理。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠染色體標(biāo)本片(四) 實(shí)驗(yàn)器具及試劑 1 實(shí)驗(yàn)器具 燒杯、量筒、恒溫水浴箱、臥式染缸、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙 2 試劑 0.2MHCl

19、,5%Ba(OH)2, 2XSSC鹽溶液，Giemsa原液、0.01M磷酸緩沖液(PH6.8)五 實(shí)驗(yàn)步驟 1 酸處理 取5-7天齡的染色體標(biāo)本片,在0.2MHCl溶液中處理15-20分鐘,蒸餾水沖洗;2 堿處理 將標(biāo)本片放入染缸中,然后加入預(yù)熱到50飽和Ba(OH)2溶液,處理10分鐘后,用50的自來水染缸中的Ba(OH)2充分沖洗;3 鹽處理 將標(biāo)本片放入2XSSC的鹽溶液中,在60溫浴30分鐘.4 染色 用10%Giemsa染液扣染10分鐘,用自來水輕輕沖洗，自然干燥。5 鏡檢觀察并繪制染色體C-帶圖實(shí)驗(yàn)八 植物基因組DNA的提取(一) 實(shí)驗(yàn)原理 DNA的提取是為了得到DNA的樣品,以供

20、進(jìn)一步的研究用.一般用酚氯仿將組織中蛋白質(zhì)等鞭它物質(zhì)從DNA中分離出,從而得到DNA。DNA提取的方法依實(shí)驗(yàn)的材料和提出來取的目的DNA不同有所不同。如：動(dòng)物組織DNA的提取、植物DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取等。(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)植物基因組DNA的提取方法。(三) 實(shí)驗(yàn)材料 韭蘭（Z. grandiflora var）葉片 (四) 器具與試劑 器具: 15ml離心管、玻棒或牙簽 試劑：8M 脲， 0.35MNacl、 0.05MTris-HClPH 8.0，0.02MEDTA，2%蔗糖，5%酚, 10%SDS, 氯仿,異戊醇, 3M醋酸鈉, TE或雙蒸水溶解試劑的配制見附錄I(五) 實(shí)驗(yàn)

21、步驟 1 取2克新鮮的葉片在液氮中研成粉末,放入15ml離心管中,加入5mlDNA提取緩沖液(8M脲,0.35MNacl,0.05M Tris-Hcl PH8.0,0.02MEDTA,2%蔗糖,5%酚),用玻棒攪勻. 2 加入1.5ml 10%SDS,倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,使之混勻,60保溫10分鐘,其間倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次. 3 從60水浴中取出,離心分相,吸取上清液入一新的離心管中. 4 向上清液中加入等體積的氯仿: 異戊醇(42:1)混勻,離心,吸取上清液. 5 重復(fù)上次步驟,至上下相間無沉淀物. 6 向上清液中加入1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷乙醇或2/3體積的異丙醇,用玻棒或牙簽纏出

22、DNA,室溫下晾干. 7 將帶有DNA的玻棒或牙簽放入15ml的離心管中,加入適量的TE或雙蒸水溶解,4貯存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)九 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA（RAPD）技術(shù)(一) 實(shí)驗(yàn)原理RAPD(randon amplified polymorphicDNA)是90年代發(fā)展起來的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性分子標(biāo)記的方法，由于它快速、簡(jiǎn)便，已廣泛用于動(dòng)植物學(xué)領(lǐng)域中，是檢測(cè)親源關(guān)系、群體遺傳學(xué)研究，檢測(cè)種群內(nèi)、種群間遺傳多態(tài)性、進(jìn)行種、亞種或種群鑒別的有效手段，在構(gòu)建遺傳位點(diǎn)圖譜和為未來研究發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)上具有潛在的應(yīng)用。RAPD的基本原理是：模板DNA在94解鏈變性后，在一定的溫度下（35-37，低于40）根據(jù)堿基互

23、補(bǔ)的原則，單個(gè)引物退火到基因組DNA模板兩條不同的位置上，在有足夠的DNA聚合酶活性的條件下，dNT從引物的3端滲入,接上與模板互補(bǔ)的種種單核苷酸,產(chǎn)生一段新的互補(bǔ)DNA鏈.如果基因組DNA分子上一段距離內(nèi)沒有反向平行與引物相互補(bǔ)的位點(diǎn),則擴(kuò)增的產(chǎn)物只呈線性增加,電泳和染色難以檢測(cè)到.當(dāng)互補(bǔ)的兩條鏈上引物結(jié)合位點(diǎn)在彼此可擴(kuò)增的中距離內(nèi)(一般為200-2000bp),通過40過循環(huán)的聚合酶鏈反應(yīng)就可以把該區(qū)內(nèi)(200-2000bp)的DNA片斷實(shí)現(xiàn)240倍的擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離和溴化乙錠染色后可直接在紫外燈下觀察和照相,得到的電泳圖譜帶可作為DNA指紋做多態(tài)性分析.(二) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)RA

24、PD擴(kuò)增的原理和分法.(三) 實(shí)驗(yàn)材料 韭蘭葉片 (四) 儀器與試劑 1 儀器: 移液管, PCR儀,小型臺(tái)式離心機(jī),旋渦混合器,電泳儀,水平電泳槽, 2 試劑: 10堿基隨機(jī)引物,GC含量為50-70%; 緩沖液(10XBuffer)、Mgcl2、dNTPs(2.5Mm for each)、TapDNA聚合酶。 3 模板DNA：為得到最佳效果，模板DNA要盡可能純，必要時(shí)可用RNase處理總DNA粗制品，提取后，乙醇沉淀，最后DNA溶于0.1XTE緩沖液中,并稀釋至1-100ng/ul.(五) 實(shí)驗(yàn)步驟 1 反應(yīng)體系（單位ul）（更大體積需要適當(dāng)延長(zhǎng)變性及退火時(shí)間）。10XBufferMg2

25、+dNTP引物模板DNA雙蒸水TapDNA酶石蠟油總計(jì)42.422227.40.2(1unit)2滴40 注: a.為使加樣準(zhǔn)確,可將反應(yīng)物需要Buffer、Mg2+、dNTP一次性取出混勻，再分到離心管中。 b、TapDNA酶也一次性取出所需總量與水混勻，再分成所需等份到各個(gè)離心管中，酶液可在預(yù)變性后再加入到反應(yīng)體系中。 c、上述操作均在無菌臺(tái)操作，嚴(yán)禁污染，所用一次性移液頭、離心管、雙蒸水、石蠟油需高溫滅菌。2 反應(yīng)程序 （1）94預(yù)變性4 min； （2）94變性1 min；（3）37復(fù)性1 min；（4）72 Cy延伸2 min；（5）重復(fù)2-4步驟40個(gè)循環(huán)；（6）72保溫10 mi

26、n；立即于0.7%1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或置于4冰箱. 3 電泳分離 由于瓊脂糖凝膠電泳簡(jiǎn)便易行,故一般用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RAPD產(chǎn)物,溴化乙錠(EB)染色,在305nm紫外線光照下擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)橙紅色熒光. 注意: 1) EB為強(qiáng)致癌物質(zhì),所有操作需帶上次性手套. 2) 盡量縮短點(diǎn)樣時(shí)間,以免樣品擴(kuò)散. 3) 紫外線有傷害眼睛的作用,驗(yàn)測(cè)時(shí)應(yīng)注意保護(hù). 4 統(tǒng)計(jì)分析 1) 根據(jù)可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)及空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)確定哪些是人為變異,去偽存真,在某一位置上擴(kuò)增產(chǎn)物“有”記為“1”，“無”記為“0”。 2）根據(jù)F=2Nxy/（Nx+Ny）計(jì)算遺傳距離，其中Nxy為兩樣品共有帶數(shù)，Nx、Ny分別為x、y

27、樣品的總擴(kuò)增帶數(shù)。 3）根據(jù)遺傳距離構(gòu)建種系發(fā)生樹（） 方法：spss/pc 軟件包中的組內(nèi)（組間）平均連鎖（within/between-group average linkage）法；MEGA（molecular evolution and geneticanalysis）中的非加權(quán)組平均（UPGMA）法和最近距離（NJ）法，RAPDist軟件等，其中RAPDist軟件則是專為公析RAPD數(shù)據(jù)編寫的。實(shí)驗(yàn)十 DNA的瓊脂糖凝膠電泳(一) 瓊脂糖凝膠電泳的特點(diǎn) 在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中，瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA的主要方法之一，所用的電泳槽有垂直、圓盤和水平三種，以水平槽最為常駐機(jī)

28、構(gòu)用。在電場(chǎng)中，PH=0.8的條件下，凝膠中帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移。不民濃度的瓊脂糖凝膠可以分離從200bp到50kb的DNA片段。在瓊脂糖凝膠中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum bromide，EB）即可在紫外線下檢測(cè)出10ng的DNA條帶。在使用過程中，可邊電泳邊觀察，而且在取出后，還可以放回去繼續(xù)電泳。如有必要，還可以從凝膠中回收DNA條帶，供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)所需。(二) 影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素 1）DNA分子的大小 在凝膠基質(zhì)中，絲狀雙鏈DNA遷移速率與其堿基對(duì)數(shù)目的常用對(duì)數(shù)值呈反比，分子越大，摩擦阻力亦越大，遷移越慢。2）瓊脂糖濃度一個(gè)特定大小的DNA片段，其遷移速

29、率在不同濃度的瓊脂糖中各不相同。DNA電泳遷移速率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線形關(guān)系。采用不同濃度的瓊脂糖凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子（見下表）不同濃度瓊脂糖凝膠的線形DNA分離范圍凝膠中瓊脂糖含量%（W/V）線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.36600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12 3) 電壓 在低電壓時(shí), 線狀DNA片段和遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，高分子量DNA片斷的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，因此，隨電壓和增加，瓊脂糖凝膠上有效分離范圍縮小。要使大于2kb的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，瓊脂糖凝膠上所加電壓不應(yīng)

30、超過5V/cm。 4）堿基組成與電壓溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受到DNA的堿基組成和凝膠電泳溫度的影響不明顯。故在瓊脂糖凝膠電泳中，不同大小DNA的片段相對(duì)遷移率在430之間不發(fā)生明顯的變化，瓊脂糖凝膠電泳一般在實(shí)溫下進(jìn)行。但濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠和低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠較為脆弱，最好在4下電泳。 5) 嵌入染料的存在 溴化乙錠用于檢驗(yàn)員測(cè)瓊脂糖中的DNA,會(huì)使線狀DNA的遷移率降低15%.染料嵌入到堆積的堿基之間,并拉長(zhǎng)線狀和帶切口的環(huán)狀DNA,使剛性更強(qiáng). 6) 離子強(qiáng)度的影響 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率.在無離子存在時(shí)(如使用蒸餾水配制凝膠)電導(dǎo)率最

31、小,DNA幾乎不移動(dòng); 而在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤用了10X電泳緩沖液),電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重的會(huì)引起凝膠熔解而DNA發(fā)生變性.天然雙鏈DNA的常駐機(jī)構(gòu)用電泳緩沖液有TAE、TBE、TPE等，通常配成濃縮液，貯存于室溫，用前稀釋。(三) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握DNA的凝膠電泳的原理和方法。(四) 實(shí)驗(yàn)材料 韭蘭葉片DNA (五) 儀器與試劑 1 儀器：穩(wěn)壓穩(wěn)電泳儀、水平電泳槽、紫外透射儀、照相機(jī)（配有紫外和橙色濾色鏡）。 2 試劑：瓊脂糖、載樣緩沖液 電泳緩沖液溴乙錠（EB）(六) 實(shí)驗(yàn)步驟1 洗凈并晾干電泳裝置所配備的塑料盤,用膠帶將其兩端開口封住,置水平工作臺(tái)(最好用水平儀校正2 根

32、據(jù)朽木不槽的容積和需要配制的濃度,準(zhǔn)確稱量適當(dāng)?shù)沫傊?轉(zhuǎn)入三角瓶中,加入需量的1X電泳緩沖液(見附錄I)。三角瓶容量不可過小，一般配的膠量不能超過容量的50%。3 在三角瓶燒瓶口上松松地包上一層厚紙，置沸水浴或微波爐中將懸浮液加熱到瓊脂糖溶解。注意不可直接在明火上加熱，在微波爐中加熱時(shí)間要控制好，防止沸出。4 待瓊脂糖凝膠溶液冷卻至60。需要時(shí)加入溴化乙錠（用水配成10%的貯存液）至終濃度為0.5%，輕輕搖勻，防止出現(xiàn)氣泡。5 趁熱將瓊脂糖凝膠溶液倒入已封好的電泳槽塑料盤中，凝膠厚度在35mm之間，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?。為防止封口處滲漏，可在倒膠前用一支玻璃吸管吸少量凝膠溶液均勻涂于封口上。6 待

33、凝膠完全凝固后，小心移去梳子和膠帶紙，放入盛有1X電泳緩沖液的電泳槽中。注意：低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠和濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠冷卻至4，并在冷室中電泳。7 向電泳槽中補(bǔ)足電泳緩沖液至恰好沒過凝膠面約1mm。8 取適量（通常為35微升）DNA樣品與23微升載樣緩沖液混勻，用移液管將混合后的樣品輕輕點(diǎn)入瓊脂糖凝膠的孔中。已知分子量大小的DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物應(yīng)同時(shí)加在凝膠的左、右兩側(cè)孔內(nèi)，在凝膠電泳中出現(xiàn)系統(tǒng)性畸變時(shí)，易于確定未知DNA的分子量大小。測(cè)量未知DNA分子量大小時(shí)，所有樣品均需要使用相同的載體緩沖液。9 蓋上電泳槽的蓋，按電泳的起始端接負(fù)極，另一端接正極接通電源，DNA在這樣的條件下，由負(fù)極向

34、正極電泳。打開電泳儀開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至15V/cm（按兩極距離計(jì)算）。如接線正確，則會(huì)在陽極和陰極處產(chǎn)生氣泡（由于發(fā)生電解），數(shù)分鐘后，溴酚藍(lán)從加樣孔中遷移到凝膠中。繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)在凝膠中遷移到適當(dāng)距離。電泳過程中，溴化乙錠向陰極移動(dòng)（與DNA相反），延長(zhǎng)電泳時(shí)間會(huì)使溴化乙錠從凝膠中遷移出來，令小片段DNA難以檢測(cè)，可在溴化乙錠溶液（0.5%）中染色3045分鐘。10 關(guān)掉電源，打開槽蓋，帶一次性手套取出凝膠，置紫外透射儀上，在紫外線下檢測(cè)電泳情況。11 攝影在紫外透射儀上，用照相機(jī)記錄電泳結(jié)果。市售紫外燈的光源發(fā)射波長(zhǎng)大多為302nm，溴化乙錠與DNA的復(fù)合物在這一波長(zhǎng)下的熒光產(chǎn)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于

35、366nm處而略低于短波長(zhǎng)（254nm）處。用高效的外線外光源（2500UW/cm2）、一塊紫外濾色鏡、一塊橙色濾色鏡及性能良好的鏡頭（=135cm）在光圈為5。6時(shí)日曝光數(shù)秒就可以攝出含有10ngDNA的條帶。延長(zhǎng)曝光時(shí)間并采用強(qiáng)紫外光源，可在膠片上記錄到僅1ngDNA所發(fā)射的熒光。按標(biāo)準(zhǔn)方法沖洗膠卷。現(xiàn)國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室有較先進(jìn)的凝膠成像系統(tǒng)，可以免去沖洗膠卷和放大照片的過程，直接在熱敏打印機(jī)上打印出質(zhì)量很高的照片來。附錄I：常用溶液的配制：1 1M Tris：取121.1g Tris堿，溶于800ml水，用濃鹽酸調(diào)PH至所需值所需 PH值： 7.4 7.6 8.9濃鹽酸大約用量： 70ml

36、60ml 42ml 定容至1000ml,高壓蒸氣滅菌.2 0.5mM2.2H2O，溶于800ml水，置于磁力攪拌器上激烈攪拌，邊攪拌邊加顆粒NaOH,至PH8.0(約用20gNaOH)，分裝，高壓蒸氣滅菌。3 5M Nacl：取 292.2gNacl，溶于800ml水，定容至1000ml，分裝，高壓蒸氣滅菌。4 3M NaAc（PH5.2）：取408gNaAc.3H2O，溶于800ml水，定容至1000ml，分裝，高壓蒸氣滅菌。5 10%SDS: BC 100g電泳純SDS(十二烷基磺酸鈉)， 溶于900ml水，置68加熱助溶,滴加濃鹽酸至PH7.2,定容至1000ml，分裝。6 10mg/ml溴化乙錠（EB）：取1Geb，懸于100ml水，置于磁力攪拌器上攪拌數(shù)小時(shí)以完全溶解，置暗色棕色瓶或包裹鋁箔的瓶中在4儲(chǔ)存。7 TE溶液：PH7.4: 10mM Tris.(PH7.4),1mM EDTA(PH8.0)PH7.6: 10mM Tris.(PH7.6),1mM EDTA(PH8.0) PH8.0: 1