蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)上

1、第四章 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)第一節(jié) 蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類蛋白質(zhì)的元素組成：C、H、O、N、S，其中含N 平均為16%，這一數(shù)據(jù)可用于蛋白質(zhì)的含量測定。（一）簡單蛋白完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。根據(jù)溶解性的不同，可將簡單蛋白分為7 類：清蛋白（溶于水）、球蛋白（溶于稀鹽溶液）、谷蛋白（溶于稀酸或稀堿）、醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）、組蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）、精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）和硬蛋白（只能溶于強(qiáng)酸）。（二）結(jié)合蛋白由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7 類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、

2、黃素蛋白和金屬蛋白。（三）按蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類1催化功能生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，沒有酶，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無法正常進(jìn)行。2結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。高等動物的膠原蛋白是主要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，占蛋白總量的1/4；細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜系統(tǒng)都是由蛋白質(zhì)與脂類組成的；動物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。3運(yùn)輸功能脊椎動物的血紅蛋白和無脊椎動物的血藍(lán)蛋白起著運(yùn)輸氧氣的作用；血液中的載脂蛋白可運(yùn)輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵；一些脂溶性激素的運(yùn)輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運(yùn)輸。4貯存功能某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和

3、胚胎或幼兒生長發(fā)育的原料。此類蛋白質(zhì)包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲存起來，供缺鐵時(shí)使用。5運(yùn)動功能肌肉中的肌球蛋白和肌動蛋白是運(yùn)動系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)像的改變引起肌肉的收縮，帶動機(jī)體運(yùn)動。細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動，從而使細(xì)菌在水中游動。6防御功能高等動物的免疫反應(yīng)是機(jī)體的一種防御機(jī)能，它主要也是通過蛋白質(zhì)（抗體）來實(shí)現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負(fù)著防御和保護(hù)功能。7調(diào)節(jié)功能某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。8感覺功能生物體對信息的識別與傳遞過程也離不開蛋

4、白質(zhì)。例如，感受味道需要味覺蛋白，視覺信息的傳遞要有視紫紅質(zhì)參與。視桿細(xì)胞中的視紫紅質(zhì)，只需1 個(gè)光子即可被激發(fā)，產(chǎn)生視覺。9遺傳調(diào)控功能遺傳信息的儲存和表達(dá)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。DNA 在在染色體中是纏繞在蛋白質(zhì)（組蛋白）上的。有些蛋白質(zhì)，如阻遏蛋白，與特定基因的表達(dá)有關(guān)。半乳糖苷酶基因的表達(dá)受到一種阻遏蛋白的抑制，當(dāng)需要合成半乳糖苷酶時(shí)經(jīng)過去阻遏作用才能表達(dá)。10其他功能某些生物能合成有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白質(zhì)合成。二、蛋白質(zhì)的形狀和大小按蛋白質(zhì)的形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量差別很大。三、蛋白質(zhì)構(gòu)像和蛋白質(zhì)

5、結(jié)構(gòu)的組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可分為不同的結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸序列。二級結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵形成的有規(guī)則的局部結(jié)構(gòu)，如螺旋、折疊等。三級結(jié)構(gòu)：球狀蛋白質(zhì)在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，借助次級鍵形成的相對獨(dú)立的完整結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)：具有三級結(jié)構(gòu)的組成單位（亞基）之間的聚合方式。四、蛋白質(zhì)功能的多樣性蛋白質(zhì)序列的多樣性(P160)決定了其功能的多樣性。如：20 種蛋白質(zhì)形成的二十肽（每種氨基酸只用1 次）可以形成的異構(gòu)體為：20！=2 1018 。又如：相對分子質(zhì)量為34000 的蛋白質(zhì)含12 種氨基酸，假定在肽鏈的任一位置，12 種氨基酸出現(xiàn)的概率相等，則34000/120=283，12283

6、 = 10305。催化：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)：如激素和反式作用因子。轉(zhuǎn)運(yùn)：如血紅蛋白、血清蛋白、載酯蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。貯存：如種子蛋白和卵清蛋白。運(yùn)動：如肌肉、微管蛋白等。結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、膠原蛋白等。支架作用：如錨定蛋白、連接蛋白等。防御和進(jìn)攻：如抗體、毒蛋白等。特殊功能：如甜蛋白、膠質(zhì)蛋白等。第二節(jié) 肽一、 肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵的C 和N 均為sp2雜化，有部分雙鍵的性質(zhì)，相關(guān)的6 個(gè)原子處于共平面，稱作肽平面，肽平面內(nèi)兩個(gè)C多處于反式構(gòu)型。二、肽的物理和化學(xué)性質(zhì)肽的等電點(diǎn)計(jì)算需先分別判斷各解離基團(tuán)的帶電荷情況，再統(tǒng)計(jì)凈電荷的量。肽的化學(xué)反應(yīng)與氨基酸類似，同時(shí)，由于肽鍵的存在，肽可以進(jìn)

7、行雙縮脲反應(yīng)。三、天然存在的活性肽主要有：肽類激素、肽類抗生素和肽類毒素。有關(guān)內(nèi)容將在后續(xù)章節(jié)介紹。均為9 肽，僅2 個(gè)氨基酸有差別，生理功能差別極大。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Leu-腦啡肽由細(xì)菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Ornithine，縮寫為Orn）第三節(jié) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定（一）一、蛋白質(zhì)測序的策略確定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。測定多肽鏈的數(shù)目。拆分多肽鏈。分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。鑒定多肽鏈的N末端和C末端氨基酸殘基。用兩種以上方法裂解多肽

8、鏈成較小的肽段。測定各肽段的氨基酸序列。拼接各肽段成完整的多肽鏈。確定二硫鍵的位置。二、N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定（一）N-末端的測定二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger 法)：2，4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。丹磺酰氯法：在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光吸收，檢測靈敏度可以達(dá)到110-9mol，比DNFB 法靈敏1

9、00 倍。異硫氰酸苯酯(PITC)法：N 末端氨基酸生成相應(yīng)的PTH（苯乙內(nèi)酰硫脲）AA，并脫離肽鏈，可連續(xù)測定N 末端氨基酸，廣泛應(yīng)用于肽鏈的氨基酸序列測定。氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)水解肽鏈，釋放氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動力學(xué)曲線，可以確定蛋白質(zhì)的N-末端殘基。（二）C-末端的測定還原法：C 末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。肼解法：多肽與肼在無水條件下加熱，可斷裂所有的肽鍵，除C 末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼化物能夠與苯甲醛縮

10、合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離，C 末端氨基酸可用紙層析鑒定。但精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。羧肽酶法：將蛋白質(zhì)在pH 8.0，30與羧肽酶一起保溫，按一定時(shí)間間隔取樣，用紙層析測定釋放出來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時(shí)間的關(guān)系，就可以知道C 末端氨基酸的排列順序。目前常用的羧肽酶有四種：A，B，C 和Y；A 和B 來自胰臟；C 來自柑桔葉；Y 來自面包酵母。羧肽酶A 能水解除Pro，Arg 和Lys 以外的所有C-末端氨基酸殘基；B 只能水解Arg 和Lys 為C-末端殘基的肽鍵。通常將二者混合使用。羧肽酶Y 可作用于任何氨基酸，因而，除用來測定C 末端氨基酸

11、外，還可以用來測定氨基酸的排列順序。三、二硫橋的斷裂四、氨基酸組成的分析一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，24 小時(shí)即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。五、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化可以用酶水解法或化學(xué)水解法將蛋白質(zhì)水解成肽段。肽段的分離純化可用層析法或電泳法。溴化氰斷裂法：羥胺斷裂法：斷裂Asn-Gly 之間的肽鍵，但專一性不強(qiáng)，也可以斷裂Asn-Leu 和Asn-Ala 之間的鍵。六、肽段氨基酸序列的測定（一）Edman 化學(xué)降解法用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準(zhǔn)確度為99%，經(jīng)60 次循環(huán)，準(zhǔn)確度為：0.9960=0.54。（二）降解法可用氨肽酶和羧肽酶，只能測出末端的幾個(gè)氨基酸。羧肽酶Y 可作用于任何氨基酸，有可能以此為基礎(chǔ)開發(fā)出新的氨基酸的順序測定儀。（三