細(xì)胞色素P450在褐飛虱和白背飛虱對(duì)吡蟲啉抗性中的作用

1、細(xì)胞色素P450在褐飛虱和白背飛虱對(duì)叱蟲咻抗性中的作用稻飛虱是水稻重要害蟲 , 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前防治稻飛虱的主要手段仍然是化學(xué)防治。然而 , 化學(xué)殺蟲劑的廣泛使用 , 使其對(duì)有機(jī)氯、 有機(jī)磷、 氨基甲酸酯、 擬除蟲菊酯及新煙堿類等殺蟲劑產(chǎn)生了抗性, 同時(shí)也加快了昆蟲對(duì)新型殺蟲劑產(chǎn)生抗性的速度。 害蟲抗藥性的分子機(jī)制主要包括靶標(biāo)敏感性降低和解毒代謝作用增強(qiáng)兩個(gè)方面。其中 , 靶標(biāo)通過突變或者量變導(dǎo)致其與殺蟲劑結(jié)合能力發(fā)生變化 , 使昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。另一方面，細(xì)胞色素P450單加氧酶、竣酸酯酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等解毒代謝酶通過基因擴(kuò)增、 表達(dá)量增加及酶活性增強(qiáng)來提高昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒代

2、謝能力 , 產(chǎn)生代謝抗性。細(xì)胞色素P450是超基因家族，存在于所有生物體內(nèi)。昆蟲 P450不僅參與合成和代謝保幼激素、蛻皮激素等多種內(nèi)源化合物 , 還能夠代謝植物毒素、殺蟲劑等外源化合物。P450作為一種多功能氧化酶，能夠代謝幾乎所有種類的殺蟲劑，在害蟲抗藥性中發(fā)揮重要作用。 雖然在實(shí)驗(yàn)室篩選的褐飛虱品系中發(fā)現(xiàn)煙堿型乙酰膽堿受體突變或者量變能夠?qū)е潞诛w虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性 , 但該機(jī)制在田間抗性種群中并不普遍。在田間抗性種群中 ,P450. 在褐飛虱對(duì)吡蟲啉抗藥性中發(fā)揮重要作用。 本文以稻飛虱為研究對(duì)象, 一方面利用殺蟲劑對(duì)敏感品系稻飛虱進(jìn)行連續(xù)篩選獲得抗性品系，并尋找抗性品系中過量表達(dá)的P45

3、0基因;另一方面通過藥劑誘導(dǎo)敏感品系 稻飛虱，尋找被誘導(dǎo)后表達(dá)量發(fā)生變化的 P450基因結(jié)合兩個(gè)方面的研究結(jié)果,通過RNAi和體外表達(dá)代謝實(shí)驗(yàn)共同分析P450在 稻飛虱對(duì)吡蟲啉抗性中的作用 , 以及與其他殺蟲劑交互抗性的關(guān)系。一、吡蟲啉對(duì)褐飛虱P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析褐飛虱基因組中共發(fā)現(xiàn) 54個(gè)P450基因，而目 前報(bào)道與叱蟲咻抗藥性相關(guān)的 P450基因只有兩個(gè)（CYP6ER相CYP6AY1）可能有 更多的P450基因與叱蟲咻抗性有關(guān)。田間檢測(cè)發(fā)現(xiàn),8 個(gè)田間種群對(duì)吡蟲啉都存在不同水平的抗性 , 尤其是湖州種群和無錫種群, 對(duì)吡蟲啉的抗性分別達(dá)到了 71.83 倍和 82.26 倍。 增效劑

4、試驗(yàn)結(jié)果表明，PBO對(duì)8個(gè)田間種群均具有明顯的增效作用，說明P450在褐飛虱抗叱 蟲咻中具有重要作用，其中湖州種群中PBO的增效作用最為顯著。通過比較叱蟲咻處理前后敏感品系褐飛虱P450基因的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)18個(gè)P450基因誘導(dǎo)后出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，其中8個(gè)屬于CYP3Clade,8個(gè)屬于CYP4Clade,2個(gè)屬于CYP2Clade,MitoClade中沒有基因被誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)。在這些被誘導(dǎo)上調(diào)的 P450 基因中有 8 個(gè)基因（CYP4CE、1 CYP417A、1 CYP425B、1CYP6AX1 CYP6AY1 CYP6CS1 CYP6CWW1 CYP6ER1J:調(diào)比率超過 2 倍，并且都

5、屬 于CYP3和CYP4Clade;CYP6CS1 CYP6CW和CYP6ER1這3 個(gè)基因上調(diào)比率超 過4彳t,并且均屬于CYP3Clade中的CYP琮族。在湖州種群中，除CYP6AX外，以上檢測(cè)8個(gè)P450基因（叱蟲咻處理后敏感品系中表達(dá)量上調(diào)2倍以上） 的表達(dá)量均顯著高于敏感品系 , 其中差異最大的 3個(gè)基因分別是 CYP6CS6（9.81） CYP6ER61（7.7f§）和 C）和 CYP6AY1（5.1 倍）。叱蟲咻 處理湖州種群48h后，除了 CYP425B1外，其余7個(gè)P450基因表達(dá)量上調(diào)的比率 都低于敏感品系。結(jié)果表明，在敏感和抗性水平較低的種群中，與抗藥性相關(guān)的P

6、450基因容易被誘導(dǎo)；而在抗性種群中，由于其P450本底表達(dá)量高，所以進(jìn)一步的誘導(dǎo)表達(dá)比較困難。二、多個(gè)P450基因共同介導(dǎo)褐飛虱對(duì)叱蟲咻的代謝抗性煙堿型乙酰膽堿受體靶標(biāo)位點(diǎn)突變或者靶標(biāo)亞基表達(dá)量變化導(dǎo)致的褐飛虱對(duì)吡蟲啉的抗藥性已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室抗性品系中被證實(shí)，然而在田間種群中P450介導(dǎo)的代謝抗性仍然 是褐飛虱對(duì)吡蟲啉抗性的主要機(jī)制。根據(jù)生測(cè)結(jié)果將一個(gè)田間褐飛虱種群分為兩個(gè)品系 : 一是通過吡蟲啉連續(xù)篩選 25代 , 獲得的抗性品系(G25); 另一個(gè)是未接觸任何殺蟲劑連續(xù)飼養(yǎng)25代, 得到的相對(duì)敏感的品系(S25,抗性倍數(shù)為2倍)。增效劑試驗(yàn)結(jié)果表明，PBQTPP和DEM 對(duì)S25都不具有增效

7、作用；PBO和TPP對(duì)G25#具有增效作用,并且PBOM具增效 作用最顯著，增效倍數(shù)達(dá)到5.88倍，因此推斷P450在褐飛虱對(duì)叱蟲咻抗性中發(fā)揮 重要作用。比較G25和S25品系中所有P450基因表達(dá)量差異發(fā)現(xiàn)：與S25相比,G25中12個(gè)P450基因過量表達(dá)，其中6個(gè)屬于CYP4Clade,5個(gè)屬于CYP3Clade,1個(gè)屬于 MitoClade,CYP2Clade 中沒有基因過量表達(dá)。CYP6AY、1 CYP6ER、1 CYP6CS、1CYP6CW1CYP4CE和 CYP425B集達(dá)量超過 5.0 倍。通過RNN擾分另I降彳氐G25品系中的CYP6AY1 CYP6ER1 CYP6CW和CYP

8、4CEdnRNAg達(dá)量后，G25對(duì)叱蟲咻的敏感性均顯著上升。體外重組的CYP6AY1 CYP6ER1 CYP6CW1 CYP4CE均能夠代詞t叱蟲咻，但其代謝能力存在顯著差異。為分析4個(gè)P450基因在褐飛虱對(duì)叱蟲咻抗性發(fā)展的不同階段中的作用 ，檢測(cè) 了經(jīng)叱蟲咻連續(xù)25代篩選的褐飛虱品系中的4個(gè)P450基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)。根據(jù)過 量表達(dá)結(jié)果推測(cè)，CYP6ER勝抗性發(fā)展所有階段都具有重要作用，其他的幾個(gè)P450基因僅僅在抗性發(fā)展的某個(gè)發(fā)展的某個(gè)階段發(fā)揮重要作用結(jié)果表明,探索P450在抗藥性中的作用時(shí)需要綜合考慮抗藥性個(gè)體P450基因過量表達(dá)、抗性發(fā)展不同階段 P450表達(dá)的變化及其對(duì)叱蟲咻的催化活性等

9、因素。三、兩種新煙堿類殺蟲劑對(duì)褐飛虱和白背飛虱P450基因誘導(dǎo)表達(dá)褐飛虱和白背飛虱是水稻上重要的害蟲 , 常混合發(fā)生, 吡蟲啉對(duì)其具有良好的殺蟲效果而被廣泛應(yīng)用 , 從而導(dǎo)致了抗藥性的產(chǎn)生。因而選擇新的替代的藥劑十分重要, 環(huán)氧蟲啶為新的順式硝基新煙堿類殺蟲劑 , 對(duì)敏感和抗吡蟲啉褐飛虱都具有較好的殺蟲活性。由于環(huán)氧蟲啶極易被水解其中間體（NMI）,本文比較了不同劑量叱蟲咻和 NMI對(duì)褐飛虱和白背飛虱P450基 因誘導(dǎo)作用的異同點(diǎn)。在白背飛虱中，相同劑量（LD85）的叱蟲咻和NMI分別處理白背飛虱后，大部 分P450基因的mRN廉達(dá)量變化情況是一致的，包括9個(gè)P450基因表達(dá)量上調(diào)及 3個(gè)P4

10、50基因表達(dá)量下調(diào)。相同劑量（LD85）的叱蟲咻分別處理白背飛虱和褐飛 虱后,12對(duì)P450同源基因中10對(duì)顯示出相同的被誘導(dǎo)模式，其中7對(duì)同源基因 被誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào) ,1 對(duì)同源基因被誘導(dǎo)表達(dá)量下調(diào)以及2對(duì)同源基因被誘導(dǎo)后表達(dá)量沒有顯著差異。相比之下，LD15、LD50和LD85三種劑量的叱蟲咻處理同一種昆蟲（褐飛虱） 后,P450被誘導(dǎo)的情況顯示出多樣性，如4個(gè)P450基因能夠被三種劑量誘導(dǎo)上調(diào)， 然而其他9個(gè)基因被誘導(dǎo)表達(dá)的情況因劑量不同而異。盡管CYP6AY和CYP6ER1都與褐飛虱對(duì)叱蟲咻抗藥性相關(guān)，但是CYP6AY基因被三種不同劑量叱蟲咻誘導(dǎo) 表達(dá)量上調(diào)，而CYP6ER只被LD5o劑量誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)。總之 , 兩種飛虱在應(yīng)對(duì)殺蟲劑的選擇壓力時(shí),P450 基因表現(xiàn)出相似的調(diào)控模式 , 盡管調(diào)控因劑量不同而異。四、吡蟲啉和吡蚜酮在褐飛虱中的交互抗性研究近些年 , 吡蚜酮成為防控褐飛虱的主要?dú)⑾x劑品種之一, 因此研究高抗吡蟲啉的褐飛虱種群對(duì)吡蚜酮的交互抗性對(duì)該藥劑使用、 褐飛虱高效化學(xué)防控都非常重要。對(duì)兩個(gè)地區(qū)的褐飛虱種群連續(xù)5 年的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn), 吡蟲啉抗性均呈現(xiàn)逐年降低的趨勢(shì)，而叱財(cái)酮抗性則逐年上升。在所有的田間種群中，增效劑PBO寸兩種殺蟲 劑都具有增效作用，證明P450在兩種殺蟲劑抗藥性中具有重要作用。褐飛虱CYP6AY和CYP6ER在對(duì)叱蟲咻抗