RNA-Seq數(shù)據(jù)質(zhì)控(RSeQC)

1、RNA-Seq質(zhì)控(RSeQC)RNA-seq 提供了有關(guān)基因組中所有轉(zhuǎn)錄元件的有價值的信息，已經(jīng)被廣泛地用于轉(zhuǎn)錄組研究。使用 RNA-seq,研究者能夠描述基因表達譜，研究選擇性剪接、鑒定新的轉(zhuǎn)錄本，檢測異常轉(zhuǎn)錄本及編碼變異等。質(zhì)量控制(QualityControl,QC)對于保證 RNA-seq 高質(zhì)量且適合隨后分析是至關(guān)重要的。我們使用 RSeQC 程序包全面地評估 RNA-seq 結(jié)果質(zhì)量，例如序列質(zhì)量、GC 偏倚、PCR 偏倚、核甘酸組成偏倚、序列深度、鏈特異性、覆蓋均一性，和基因組結(jié)構(gòu)上的片段分布等，以確保后續(xù)分析的可靠性。基于原始測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控(例如 FastQC)不足以保證 R

2、NA-seq 數(shù)據(jù)的可用性。測序深度必須飽和，以便執(zhí)行許多 RNA-seq 應(yīng)用，例如表達譜，選擇性剪接分析，新亞型(isoform)鑒定，轉(zhuǎn)錄組重建等。非飽和測序深度給出不準(zhǔn)確的評估(例如 RPKM 和剪接索引)，不能檢測低豐度剪接聯(lián)結(jié)點(splicejunctions),因此限制了許多分析的準(zhǔn)確性。有許多工具，例女口 FastQC(http:/www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)、htSeqT001sFASTX-ToolKit(/fastx_toolkit)和 SAMStat,

3、但是都集中于原始序列相關(guān)的度量。RNA-SeQC 缺乏許多重要的功能，例如飽和性檢查。RSeQC 被開發(fā)以解決這些需求。基本模塊快速檢查：序列質(zhì)量、核甘酸組成偏倚、PCR 偏倚和 GC 偏倚。RNA-seq 特異模塊：1) )bat_stat.py 比對片段檢查(QC 失敗、uniquemapped、splicemapped、mapped 至 U 合適對的 reads 等)2)inner_distance.py 配對 reads 間的內(nèi)部距離分布，應(yīng)該與割膠大小匹配。3)geneBody.coverage.py 將所有轉(zhuǎn)錄本縮放到 100nt,并計算每個核甘酸覆蓋的 reads 數(shù)，最后計算出

4、一個沿 genebody 的覆蓋譜。020406080100percentile。1genebody(5-方*)4)read_distribution.py 計算比對至 U 編碼 exons、5UTRexons、3UTRexons、introns 和 intergenic 區(qū)的 read 比例。例如對于 polyA+RNA-seq 的實驗方案，reads 傾向于在 3UTR 過代表。5)RPKMsaturation.py 通過對總的比對 reads 重采 1(jackknifing),評估在當(dāng)前測序深度下的 RPKMs。ChinaPubMedi事使用相對錯誤率來測量評估的 RPKM 的準(zhǔn)確性(

5、100X|RPKMobs-RPKMreal|/RPKMreal)ResamplingpercentageResamplingpercentage7）infer_experiment.py 通過對 BAM 文件進行采樣，判斷測序是否是鏈特異的，若是的話，是怎么分布的。8）junction_annotation.py 將所有檢測至 U 的 splicejunction 分為 known,completenovel 和partialnovel(與 refgenome 相比)。 J JO8Q_PC8JO8Q_PC8J 6)junction_saturation.pyE003OSEOOLsOOOLX)Suo-BumpsldsBE003OSEOOLsOOOLX)Suo-BumpsldsBJGqEnNJGqEnNF-ANjuncoony-knownjunctionnovelJunctionF10F100 0I80I80i60i604 40 0i i2020Itiriiririiiriiiitii5153045607590判斷當(dāng)前測序深度是否足夠用來執(zhí)行選擇性剪接分析。Splkiejunctionannotation9）RPKM_count.py 計算原始 reads 計數(shù)和 RPKM 值（每個 exon、intron 及 mRNA 區(qū)）