流式細胞儀操作規(guī)程-SOP

1、 流式細胞儀操作規(guī)程目錄1：淋巴細胞亞群測定及絕對計數(shù)2：活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的檢測3：HLA-B27測定4：CD55CD59測定5：干細胞檢測和絕對計數(shù)6：白血病免疫分型測定7：淋巴細胞T細胞亞群細胞內因子IFN-/IL-4測定8：細胞周期分析9：活化血小板檢測10：血小板抗體測定11：紅細胞抗體測定12：粒細胞抗體測定淋巴細胞亞群測定(流式細胞儀) 醫(yī)院檢驗科操作規(guī)程文件號：200 年 月 日起實施第1版(共3頁) 本規(guī)程每2年復審一次 復審日期： 年 月 日 復審人： 規(guī)程編寫者： 審 批 者： 批準日期： 年 月 日 文件分發(fā)部門和或個人 院檔案室保管者： 檢驗科 主任：

2、檢驗科 實驗室： 淋巴細胞亞群測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，從而得到淋巴細胞亞群的百分數(shù)，加入Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。淋巴細胞表面抗原分布如下：T淋巴細胞：CD3+；B淋巴細胞：CD3-，CDl9+；輔助性T淋巴細胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細胞：CD3+CD8+；NK細胞：CD3-CDl6+56+等。根據(jù)淋巴細胞膜上CD分子表達的不同，流式細胞儀可以分辨出淋巴細胞及其各種不同

3、的亞群，利用計算機軟件計算出淋巴細胞亞群的百分數(shù)，加入Flow-Count組會自動得出絕對計數(shù)。標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。 3樣本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核細胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 28 (CD45/4/8/3 No.660701

4、3 CD45/56/19/3 No.6607073 CD4/8/3 No.IM1650 同型對照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液

5、(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進

6、行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）6)需要做絕對計數(shù)的指標，在相應管中加入與血樣等量的Flow-Count(務必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機) 報告結果 報告百分數(shù)（和絕對值）操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值(百分數(shù)（絕對值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03臨

7、床意義1.T、B淋巴細胞亞群是重要的免疫狀態(tài)檢測指標，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床診斷、病情判斷、治療等價值。臨床常用ThTs比值來判斷病人的免疫狀況。ThTs比值升高：表示免疫功能亢進：見于自身免疫性疾病，如SLE、類風濕性關節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝和活動性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細胞減少患者。2：NK細胞主要破壞各種腫瘤細胞和感染某些病毒、細菌的細胞，所以在抗腫瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫

8、瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、應用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長而減退。NK細胞也參與第二型超敏反應和移植物抗宿反應，白介素-2治療后；外周血NK細胞增加。方案（Protocol）1.選參數(shù)點擊點擊4色3色點擊（命名，點擊save） 2.畫圖 結果 此圖為CD45圈門如果做絕對計數(shù)，則填寫Flow-Count的濃度選中cell/ul即可活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞

9、儀上進行分析，從而得到相應各亞群的百分數(shù)。活化淋巴細胞表面抗原為CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是記憶型T細胞。CD3+/CD45RA+是純真型T細胞。 標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。 3樣本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核細胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)

10、格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 28 (CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646 CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834 CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ） 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.854

11、6930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測

12、定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5)上機測樣（可根據(jù)樣本情況選擇洗或不洗上樣）報告結果 報告百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值(百分數(shù)) CD3+/HLA-DR+ 3.1±1.3% CD3+/CD25+ 15.9±3.7% CD3+/CD45RO+ 3.3±1.55% CD3+/CD45RA+/CD4+ 20.51±3.64% 臨床意義1.HLA-DR、CD25、CD69是T細胞活化各個時期表達的標志性抗原，對其進行檢測可以判斷出疾病的進程，有助于臨床疾病的輔助診斷、預后和治療。如活化狀態(tài)的監(jiān)測是對機體移植免疫狀

13、況判斷的最主要依據(jù)，有助于臨床選擇治療方案，CD25+/CD3+ >5-10%提示排斥、持續(xù)增加提示應作病理活檢；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機體內各種T細胞之間以及與其他免疫細胞之間在數(shù)量上保持一定比例，如果它們之間比例失調就會引起免疫功能紊亂，將導致機體免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測淋巴細胞各種亞群有助于疾病的診斷、預后和治療。CD45RA、CD45RO均為T細胞的輔助分子，CD45RA+純真型T細胞當免疫力下降時減少；CD45RO+記憶型T細胞對第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢性感

14、染疾病中減少。方案（Protocol）同淋巴細胞亞群檢測結果（Result）HLA-B27測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE單克隆抗體加入到全血中，與白細胞膜上相應的抗體結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，測定HLA-B7陰性而HLA-B27陽性細胞的平均熒光強度和所占的百分比。 標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。

15、 3樣本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核 細胞。 4溶血樣本不能用。試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 (HLA-B27/HLA-B7 No.IM1502 同型對照IgG1IgG2a No.IM1389) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光

16、微球 液體 10ML 2-8 質控品 BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情況隨時進行校準。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇

17、35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5)洗、離心、上機測樣（備注： 測B27一定要至少洗一遍方可上機檢測）報告結果 報告陰陽性操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值 陽性：HLA-B27陽性而HLA-B7陰性細胞的平均熒光強度在5.0以上，陽性率>90%。 臨床意義HLA復合體位于第6號染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長度約3000-4000KB，占人體整個基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I類基因中B位點上的一個等位基因，與多種疾病具有相關性，尤其

18、是強直性脊柱炎。HLA-B27基因屬于型MHC基因，所有有核細胞上均有表達，尤其是淋巴細胞表面含量豐富，人們發(fā)現(xiàn)HLA-B27抗原表達與強直性脊柱炎有高度的相關性，超過90%的強直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表達陽性，而正常人群中僅5-10%的認為陽性。由于強直性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測在疾病的診斷中具有重要意義，HLA-B27的檢測是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個重要指標。方案（Protocol）1.選參數(shù)點擊點擊 鍵入文件名，點擊Save2.畫圖 結果1. positive (+) X-Mean=17.12. negative(-) X-Mean=

19、1.2 X-Mean=5.8CD55/CD59測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細胞和白細胞膜上CD55和CD59分子的表達量和缺乏表達細胞的數(shù)量對PNH診斷和鑒別有重要意義。血細胞(紅細胞和白細胞)通過膜上的抗原分子與熒光素標記的CD55或CD59的多克隆抗體結合。用流式細胞儀檢測CD55或CD59表達陽性細胞百分數(shù)。 標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。 3溶血樣本不能

20、用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 1ML 28 (CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE No.IM2726) 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質控品 BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情況隨時進行校準。儀器 BeckmanCoulter EPICS

21、 XL/FC500/Altra 樣本制備:(一)白細胞CD55CD59檢測1準備2支流式細胞儀專用管，分別標記。分別向二管中加入樣品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）3離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應的同型對照10ul。避光20-30分鐘。4洗滌離心 5上機測樣(二)紅細胞CD55CD59檢測 1準備2支流式細胞儀專用管

22、，分別標記 2分別加入CD55CD59 10ul和相應的同型對照10ul。 3向二管中加入1：200稀釋的樣品100ul（可根據(jù)紅細胞的數(shù)量調整），避光20-30分鐘。 4洗滌離心。5混勻、上機測樣。 報告結果 報告百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值 CD55>97% CD59>97% PNH的臨界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的診斷值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒細胞CD59>84% 臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時CD55和CD59明顯減低和缺如。方案（P

23、rotocol）(同HLA-B27) 結果1.RBC: normal 2.RBC: abnormal 3.WBC干細胞檢測和絕對計數(shù)方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，從而得到百分數(shù)，加入Flow-Count即可得出絕對計數(shù)。標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。 3樣

24、本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核細胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C N

25、o.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 1)按照要求，分別向已編好號的試管中加入10 ul單克隆抗體和同型對照2)分別向試管中加入混勻的100u1抗凝血。3)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4)溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇

26、35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5)需要做絕對計數(shù)時，在相應管中加入與血樣等量的Flow-Count(務必做到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count，而且加完即上機)6)上機測樣報告結果 報告百分數(shù)（和絕對值）操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值(百分數(shù)（絕對值）) CD34+/CD45+ 0.58±0.29% 臨床意義目前把CD34作為造血干細胞的主要標志，CD34陽性細胞計數(shù)作為造血干細胞水平定量的檢測方法。方案（Protocol）同

27、淋巴細胞亞群檢測結果（Result） 白血病免疫分型測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與細胞膜上或膜內相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀上進行分析，從而得到百分數(shù)。標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 骨髓采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝 要求 1樣本量1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。 3樣本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋

28、，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核細胞。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：單克隆抗體 液體 28 (CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652Flow-Count熒光微球 No.7547053) 2：全血溶血試劑(Q-Prep) 液體(No.7546946) A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 (Optilyse C No.IM1401) 液體 室溫 3：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 4：清洗液(No.854693

29、0) 液體 5L 室溫 5：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-樣本制備： 細胞膜表面抗原1首先準備所需的管，并在管上標記上欲加入的抗體。2首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3然后，按管上的標記，加入相應抗體各10ul(注意：必須是FITC和PE標記的抗體搭配)4各管中加入標本(骨髓或外周血)30100u1(根據(jù)細胞的多少決定)，振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5溶血：a. OptiLyse C(按說明書步驟溶血) b. 使用COULTER QPREP制備

30、系統(tǒng)開機-顯示READY燈亮-選擇35SEC燈亮-開門-放入試管關門-自動進行溶血-顯示READY燈亮-開門-取出試管-再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）細胞漿和核抗原1準備所需的管，并在管上標記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。2首先每管中加入標本(骨髓或外周血)100ul(根據(jù)細胞的多少決定)，5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3每管中加入固定液100ul，劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4各管中加入PBS4ml。5300g離心5分鐘后，棄去上清液，振蕩混勻。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜劑100ul，輕輕混勻，室溫避光5分

31、鐘。 7加抗體，陰性對照管中加入10ul，其余各管加入相應抗體各10ul，室溫避光15分鐘。8各管中加入4mlPBS，振蕩混勻。9300g離心5分鐘后，棄去上清液。10各管中加入PBS500ul，振蕩混勻。11上機測樣報告結果 報告百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值 CD34+<5% MPO+<5% 粒系<20% 淋系<30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案（Protocol）T細胞亞群細胞內因子IFN-/IL-4檢測方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMA，Ionomyc

32、in和Monensin存在下短期培養(yǎng)(輔助性T細胞通過細胞因子IFN-、IL-4的產生分為Thl、Th2兩個亞群。淋巴細胞活化以后才分泌細胞因子，且迅速分泌到細胞外。因此，利用刺激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細胞，然后用蛋白轉運抑制劑Monensin阻止細胞因子分泌到細胞外，使細胞因子在細胞內滯留到一定的量)，然后進行細胞膜表面抗原和細胞內細胞因子染色，使用流式細胞儀對CD4+細胞內的IFN-和IL-4進行測定。 標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 肝素抗凝血 要求 1樣本量至少1ml。 2樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不

33、能用。 3樣本白細胞計數(shù)應在4.0-10.0×109/L之間。若>10.0×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<4.0×109/L，應分離單個核 細胞。 4溶血樣本不能用。試劑 淋巴細胞培養(yǎng)體系(自配) 成分：刺激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國SIGMA公司。 單克隆抗體 ( BeckmanCoulter公司) CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-FITC(No.IM2716)。 質控品 BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內保持

34、穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情況隨時進行校準。儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 細胞培養(yǎng)與染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMIl640洗滌一次，將細胞加入培養(yǎng)體系中，5C02 37孵育18小時，取出后以PBS洗一次。用專用細胞內因子試劑進行細胞固定、透膜。將細胞分成兩管，其一為測定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型對照，室溫避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測。流式細胞儀測定 打開流式細胞儀及氬激光光源(488nm)預熱20min，同

35、時儀器自動初始化；用標準熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標本，每份標本檢測50000以上細胞，在前向散射光(FS)和測向散射光(SSC)散點圖中圈定淋巴細胞群，然后分析CD4陽性細胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表達。 淋巴細胞在FSSSC散點圖中位置，即A門內細胞； A門內CD4陽性細胞，即B門內細胞； B門內TH細胞亞群分布： 1區(qū)數(shù)值-Th 1細胞 (%) 4區(qū)數(shù)值-Th 2細胞 (%) 2區(qū)數(shù)值-Th 0細胞 (%)報告結果 報告百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 正常參考值 Thl(IFN-)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50&

36、#177;0.44% ThO ：0.51±0.26% 臨床意義淋巴細胞均分泌多種細胞因子：Thl細胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2細胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-為Thl最特異分泌的細胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細胞因子，所以可根據(jù)分泌的細胞因子來區(qū)分Thl與Th2。Thl為IFN-+，Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)(人的正常生理狀態(tài)、即未受到任何刺激下Th0分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅含有極少量的Thl和Th2細胞，這時我們所能檢測的胞內的IFN-和IL-4也微乎其微。當Th細胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺

37、激，其中Th0即會向Thl或Th2大量分化，此時我們檢測到的IFN-和IL-4也較多。本實驗的檢測實際上是檢測Th細胞對刺激素刺激的反應能力。方案（Protocol） 細胞周期分析方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等) 與細胞內DNA堿基結合，被熒光染料染色的細胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DNA含量標本采集與處理 檢測對象 實體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細胞 要求 1實體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細胞如果不能立即做應用冷乙醇固定，20可保存23個

38、月，70可保存半年以上。 2樣本計數(shù)應在1.0×106/ml 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：DNA-Prep試劑系統(tǒng) 液體 28 （No.6607055） （包括DNA-Prep LPR和 DNA-Prep 染料） 2：鞘液(No.8546859) 液體 20L 室溫 3：清洗液(No.8546930) 液體 5L 室溫 4：熒光微球(No.6605359) 液體 10ML 2-8(Flow-Check) 儀器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 樣本制備： 灌洗液或培養(yǎng)細胞1 PBS洗，稀釋為1.0×106/ml，

39、取100ul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep 染料1ml,室溫避光15分鐘。2 過300目濾網，上機檢測。實體（腫瘤）組織1 單細胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網上，下置一平皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。將平皿中的混懸液用300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液，以500800轉離心沉淀2分鐘。2 染色：同上3 上機檢測石蠟塊1 脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，35片，放入二甲苯中室溫放置24小時，更換二甲苯室溫再置24小時。取出加無水乙醇10分

40、鐘，依次加95乙醇、70乙醇、50乙醇及雙蒸水各10分鐘。2 單細胞懸液制備及染色：同上3 上機檢測報告結果 報告各期的百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值 臨床意義DNA倍體分析用于腫瘤早期診斷、良惡性腫瘤判斷、腫瘤預后、治療方案的選擇，正常組織和良性腫瘤DNA均為二倍體，惡性腫瘤時則出現(xiàn)異倍體。方案（Protocol）1.選參數(shù) 選擇Cytometer Control點擊Parameters后2.畫圖 結果（Result）血小板膜表面抗體測定方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 間接免疫熒光法。FITC標記的各型多克隆抗體，加到經離心富

41、集的血小板中，與血小板膜上的相應的IgG-Fc片段結合，經過洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞儀上進行分析。 標本采集與處理 受檢者的準備 檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。 采集部位 靜脈采血抗凝劑 EDTA或肝素抗凝血 要求 1樣本量2ml。 2樣本應在采集后6小時內完成，冷凍的標本或已固定的標本不能用。 3樣本血小板計數(shù)應在150-450×109/L之間。若>450×109/L， 樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若<150×109/L，應多采集進行富集達到流式檢測的細胞數(shù)。 4溶血樣本不能用。 試劑 品牌 劑型 規(guī)格 貯存 貝克曼庫爾特成分 1：一抗 凍

42、干 0.2mg -20小鼠抗IgD(No.IM0284)IgG(No.IM0279)IgM(No.IM0285) 二抗：山羊抗小鼠IgG(H+L) (No.IM0819)凍干 1mg -20 2：全血溶血試劑 液體 A：甲酸 液體 70ML 室溫 B：碳酸鈉等 液體 32ML 室溫 C：多聚甲醛 液體 14ML 室溫 3：鞘液 液體 20L 室溫 4：清洗液 液體 5L 室溫 5：熒光微球 液體 10ML 2-8 質控品 BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8保存，可在有效期內保持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情況隨時進行校準。儀器 BeckmanCo

43、ulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,棄上清，重復一次。3) 分別向試管中加入準備好的10u1含血小板的PBS（血小板的量約為106）（血小板若在正常范圍，稀釋到原量直接取10u1。）。4) 分別向已編好號的試管中依次加入一抗和二抗（設對照）5)混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘6)洗或不洗，上機測樣全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,棄上清，后同上3）6）報告結果 報告百分數(shù)操作性能 精密度 批內五次重復CV<2 參考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 臨床意義為免疫性血小板減少性紫癜(ITP)診斷、治療、預后估計的重要指標，在ITP、膠原性疾病時升高。方案（Protocol） 紅細胞膜蛋白結構測定（紅細胞抗體）方法 流式細胞儀(BeckmanCoulter，貝克曼庫爾特)原理： 直接免疫熒光法。FI