2022年細(xì)菌脂多糖免疫對(duì)結(jié)腸炎小鼠TNF-α-表達(dá)的影響-(2)匯總

1、細(xì)菌脂多糖免疫對(duì)結(jié)腸炎小鼠TNF-表達(dá)的影響摘要目的：為了研究細(xì)菌脂多糖免疫對(duì)結(jié)腸炎小鼠TNF-表達(dá)的影響并探討炎癥性腸炎的發(fā)生機(jī)制。方法：設(shè)計(jì)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，將30只BALB/C小鼠隨機(jī)分為三組：觀察組10只注射細(xì)菌脂多糖免疫后誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型、模型組10只注射生理鹽水后誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型和對(duì)照組10只不做任何處理并注射生理鹽水，4周后處死并取結(jié)腸組織標(biāo)本檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)炎癥介質(zhì)TNF-的表達(dá)情況并進(jìn)展比擬。結(jié)果：觀察組血清TNF-mRNA含量均值為16.36±1.28%，結(jié)腸TNF-含量均值為23.25±2.15%，數(shù)據(jù)結(jié)果與其他兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0

2、.05。病理切片觀察結(jié)果：觀察組小鼠的潰瘍點(diǎn)、靡爛點(diǎn)個(gè)數(shù)均較模型組明顯減少，同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞減少程度也明顯較輕。結(jié)論：細(xì)菌脂多糖可降低小鼠結(jié)腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量，在病理切片結(jié)果中可明顯觀察到經(jīng)過(guò)LPS免疫小鼠的病理狀態(tài)明顯減輕，這可能為其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞細(xì)菌脂多糖；潰瘍性結(jié)腸炎；腫瘤壞死因子Effect of LSP on the expression of TNF- immunity in mice with colitisAbstract Objective: To study the influence of LSP on the expr

3、ession of TNF- immunological colitis in mice and to explore the mechanisms of IBD. Methods: the experiment animal model design, 30 male BALB/C mice were randomly divided into three groups: the observation group 10 (IBD models were induced by injection of LSP after immunization), 10 rats in model gro

4、up (IBD mice models were induced by injection of saline) and 10 in control group (without any treatment and injection of physiological saline), 4 weeks after the colon tissue samples were taken for detection, and compared the expression of inflammatory mediators in TNF- statistics. Results: in the o

5、bservation group, serum TNF- mRNA content was (16.36 ± 1.28)%, the mean content of TNF- colon was (23.25 ± 2.15)%, with statistical significance of data and other differences between the two groups (P<0.05). Pathological observation: the number of the observation group mice ulcer, corru

6、pt are compared with model group were significantly reduced, and the infiltration of inflammatory cells and goblet cells decreased significantly lighter.Conclusion: LSP can reduce the content of the colon mucosa of TNF- and serum TNF- , in pathological results can be clearly observed the pathologica

7、l state of mice immunized with LPS significantly reduced, which may provide a theoretical basis for the treatment of ulcerative colitiKeywordsLSP; IBD; tumor necrosis factor炎癥性腸病inflammatory bowel disease,IBD是一類由多種不明病因引起的、異常免疫介導(dǎo)的腸道慢性及復(fù)發(fā)性炎癥，有終身復(fù)發(fā)傾向，主要疾病類型有潰瘍性結(jié)腸炎u(yù)lcerative colitis,UC和克羅恩病Crohn disease

8、,CD。目前病因不明確，有學(xué)者認(rèn)為環(huán)境、遺傳、微生物感染和腸壁黏膜免疫異常，腸道黏膜損失等因素共同作用于IBD的發(fā)作1。以ELISA法檢測(cè)IBD及其他胃腸道疾病患者抗結(jié)腸抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者抗結(jié)腸抗體出現(xiàn)率為36%，明顯高于其他胃腸道疾病患者2 。細(xì)菌脂多糖LPS是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素，在感染/炎癥的發(fā)病機(jī)制中起著十分重要的作用。Toll蛋白家族在構(gòu)造上有高度同源性,且均在天然免疫防御中起重要作用。目前有報(bào)道的TLR已達(dá)10種，其中TLR4多分布在巨噬細(xì)胞，B/T淋巴細(xì)胞及脾，肝，肺及胎盤等組織中，主要識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌外表的脂多糖LPS，引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-B的活化及炎癥因子的釋放3。

9、因此,筆者設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)研究實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的血清和腸道的TNF-表達(dá)情況，據(jù)此探討炎癥性腸病的發(fā)生機(jī)制，為炎癥性腸病的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。1資料與方法1.1實(shí)驗(yàn)資料 30只BALB/C雄性小鼠SPF級(jí)均由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量范圍為22g-24g，平均為23.2±1.1g，均為7-8周齡，分組方法：30只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為觀察組、模型組和對(duì)照組三組，每組10只，觀察組和模型組均首先通過(guò)三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液灌腸誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察組小鼠造模后注射細(xì)菌脂多糖免疫，模型組給予同等劑量的生理鹽水，對(duì)照組小鼠不造模，正常飼養(yǎng)，與觀察組和模型組

10、小鼠同期給予等劑量的生理鹽水。所有小鼠的在飼養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境條件符合中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施?GB14925-2001對(duì)屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小鼠的飼養(yǎng)管理和實(shí)驗(yàn)操作符合?北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例?等法規(guī)的要求。1.2給藥方法：觀察組小鼠使用細(xì)菌脂多糖進(jìn)展免疫，具體方法為給予(LPS 1mg+NS 15 ml)+佐劑15ml,配制成終濃度0.03mg/ml(0.003mg/0.1ml)的試劑，用量為0.3mg/1000g,0.003mg/0.1ml/10g，小鼠腹腔注射3ml+佐劑3ml，模型組小鼠與對(duì)照組小鼠分別給予適量的生理鹽水+15 ml 完全弗氏佐劑,每次接種0.3mg/1

11、000g，所有30只實(shí)驗(yàn)小鼠均每1周免疫1次，共4次，初次免疫加完全弗氏佐劑，以后免疫用不完全弗氏佐劑。1.3造模方法4 觀察組與模型組的實(shí)驗(yàn)小鼠均在末次免疫3周后禁食24小時(shí)，用5%水合氯醛0.15mL或3%戊巴比妥腹腔注射，使小鼠輕度麻醉，約25min以后用套接了涂有石蠟油的小號(hào)導(dǎo)尿管直徑1.5mm硅膠管的1mL注射器抽吸TNBS乙醇溶液，從肛門將導(dǎo)尿管緩慢插入約3.5cm3-4cm，然后將藥液緩慢注入，停20s后抽出導(dǎo)尿管，再將小鼠倒懸約30s后放入盒中，自然清醒。1.4標(biāo)本采集 三組小鼠在同一時(shí)間范圍內(nèi)收集血清并制作標(biāo)本，標(biāo)本收集方法為：抓取小鼠，用鑷子夾出眼球，放血至EP管，室溫放置

12、約1小時(shí)，3500rpm離心15分鐘，收集血清至EP管，-200保存。標(biāo)本制作方法為：處死小鼠，腹部消毒，無(wú)菌剖開(kāi)腹部，別離結(jié)腸，留取距肛門4cm左右的結(jié)腸組織，沿腸系膜緣剪開(kāi)腸腔，PBS沖洗糞便，H-E染色，其余標(biāo)本錫箔包裹，液氮冷凍，-80保存，觀察測(cè)量結(jié)腸的長(zhǎng)度，拍照。1.5 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 無(wú)菌條件下摘取小鼠結(jié)腸，應(yīng)用10福爾馬林固定24 h，脫水處理后石蠟包埋，每隔4 um連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察小鼠結(jié)腸病理學(xué)特征。1.6 ELISA法檢測(cè)TNF-在血清和結(jié)腸組織的表達(dá)：取血清及結(jié)腸組織樣本嚴(yán)格按照小鼠放射免疫試劑盒說(shuō)明書要求檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-及結(jié)腸組織的表達(dá)情況。1

13、.7DAI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)各組小鼠按照以下表格進(jìn)展DAI潰瘍性結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)估5。表1：DAI分值=糞便粘稠度+體質(zhì)量減輕率+血便/31.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選擇spss19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)展分析，三組獨(dú)立樣本計(jì)量資料平均值數(shù)據(jù)以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示：組間比擬方法選擇單因素方差分析one-way ANOVA，兩兩比擬方法選擇LSD檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本計(jì)量資料組間比擬方法選擇t檢驗(yàn)，均以0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，行雙邊檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1病理形態(tài)學(xué)的表現(xiàn)：在光鏡下觀察，對(duì)照組小鼠的結(jié)腸黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)那么、構(gòu)造清楚，無(wú)潰瘍、無(wú)靡爛點(diǎn)及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)見(jiàn)圖1。模型組小鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)多個(gè)潰瘍

14、出現(xiàn)，靡爛點(diǎn)散在分布，黏膜淋B細(xì)胞浸渭嚴(yán)重t杯狀細(xì)胞硪少明顯見(jiàn)圖2。觀察組小鼠在潰瘍點(diǎn)、靡爛點(diǎn)個(gè)數(shù)均較模型組明顯減少，同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞減少程度也明顯較輕見(jiàn)圖3。圖1：對(duì)照組小鼠病理典型代表圖例圖2：模型組小鼠病理典型代表圖例圖3：觀察組小鼠病理典型代表圖例2.2 細(xì)菌脂多糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎血清TNF-及結(jié)腸TNF-含量的影響 觀察組血清TNF-mRNA含量均值為16.36±1.28%，結(jié)腸TNF-含量均值為23.25±2.15%，F(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果顯示與其他兩組實(shí)驗(yàn)小鼠數(shù)據(jù)不一致P<0.05，拒絕H0假設(shè)，承受H1假設(shè)，LSD兩兩比擬結(jié)果顯示：觀察組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明顯高于對(duì)

15、照組t=18.90，P<0.05，但明顯低于模型組t=8.94，P<0.05,數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)結(jié)果如下表2：表2：三組小鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表組別N只免疫劑量血清TNF-mRNA含量(%)結(jié)腸TNF-含量(%)觀察組103ml+佐劑3ml16.36±1.2823.25±2.15對(duì)照組103mL生理鹽水+佐劑3ml15.50±1.0116.42±1.87模型組103mL生理鹽水+佐劑3ml28.64±2.3534.37±2.20F值25.5816.71P<0.05<0.052.3DAI評(píng)估結(jié)果 記錄

16、第五天到第十天時(shí)，觀察組與模型組小鼠的出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量降低和粘稠糊狀血便表現(xiàn)，兩組小鼠DAI評(píng)分結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3.5±0.2分VS3.4±0.3分t=1.12，P>0.05，而正常對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)上述異常生理表現(xiàn)。從第十天開(kāi)場(chǎng)，經(jīng)過(guò)LSP免疫的模型組不再出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量減輕現(xiàn)象，糞便逐漸成形，評(píng)分結(jié)果明顯高于模型組DAI評(píng)分結(jié)果3.4±0.3分VS2.7±0.2分t=7.85，P<0.05。3討論本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌脂多糖免疫小鼠后誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性炎癥性腸病的炎癥反響程度，檢測(cè)炎癥介質(zhì)TNF在血清和結(jié)腸組織的表達(dá)情況，首先通過(guò)病理形態(tài)觀察

17、結(jié)果進(jìn)展定性分析：觀察組小鼠在通過(guò)細(xì)菌脂多糖免疫后，潰瘍點(diǎn)、靡爛點(diǎn)個(gè)數(shù)均較模型組明顯減少，同時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和杯狀細(xì)胞減少程度也明顯較輕，結(jié)合對(duì)照組小鼠觀察結(jié)果可以推斷出細(xì)菌脂多糖可降低小鼠結(jié)腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量。通過(guò)ELISA法檢測(cè)TNF-在血清和結(jié)腸組織的表達(dá)情況來(lái)進(jìn)展定量分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明了結(jié)腸炎小鼠在經(jīng)過(guò)細(xì)菌脂多糖免疫后，其血清TNF-mRNA含量和結(jié)腸TNF-含量均有明顯的改善，與模型組數(shù)據(jù)結(jié)果相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可以進(jìn)一步得出結(jié)論：細(xì)菌脂多糖可降低小鼠結(jié)腸粘膜TNF-及血清TNF-的含量，這可能為其對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療提供理論依據(jù)。革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的重要成

18、分之一是細(xì)菌內(nèi)毒素，它在細(xì)菌的感染機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，也被認(rèn)為是引起全身性炎癥綜合癥的主要物質(zhì)之一。LPS在人體內(nèi)能夠刺激巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，促使細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而引起病理生理的損傷。但是少量的LPS不但能夠使單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)活化，而且能夠加速內(nèi)源性細(xì)胞因子的釋放。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)6-7：短期內(nèi)給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致死劑量的內(nèi)毒素后，因?yàn)閮?nèi)毒素而產(chǎn)生的發(fā)熱或者休克等生理表現(xiàn)消失，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受在生物體內(nèi)是一種保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，是生物體在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成的，它能防止內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體持續(xù)的、過(guò)度的刺激，對(duì)增強(qiáng)機(jī)體的防御功能具有重要的意義。實(shí)驗(yàn)中選擇炎癥介質(zhì)TNF-的表達(dá)情況作為判

19、斷潰瘍性結(jié)腸炎病情的指標(biāo)，主要是因?yàn)門NF-炎癥因子能夠準(zhǔn)確的反映出小鼠結(jié)腸炎情況，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道8-9，利用炎癥介質(zhì)TNF-的抗體治療結(jié)腸炎具有起效快、治療預(yù)后效果好的特點(diǎn)，并且在用藥2月后再給藥，能夠有效預(yù)防結(jié)腸炎的復(fù)發(fā)，這也近一步說(shuō)明了TNF-炎癥因子是導(dǎo)致結(jié)腸炎發(fā)病的關(guān)鍵因子。從這一點(diǎn)出發(fā)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)10-13探討炎癥性腸炎的發(fā)生機(jī)制如下：TNF炎癥因子有兩個(gè)亞型：TNF-和TNF-，均屬于促炎細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生，能夠參與細(xì)胞的免疫反響過(guò)程中，而參與體液免疫反響的抗炎性因子主要包括由免疫T細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IL-4，IL-5，IL-10和IL-13等，這些抗炎細(xì)胞因

20、子和促炎細(xì)胞因子之間的分泌代謝失衡，是引起結(jié)腸炎發(fā)病的重要作用機(jī)制之一，最后，關(guān)于炎癥性腸炎的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制有一個(gè)被廣泛認(rèn)同的觀點(diǎn)，即炎癥性腸炎患者體內(nèi)的腸道免疫系統(tǒng)對(duì)自身的抗原或者外來(lái)抗原出現(xiàn)異常反響而致病，但是自身免疫反響產(chǎn)生的方式和損傷機(jī)制還沒(méi)有統(tǒng)一的定論，需要進(jìn)展進(jìn)一步的研究。參考文獻(xiàn)：1Xavier RJ，odolsky DK. Unravealing the pathogenesis of inflammatory bowel diseaseJNature，2021，448(7152):427-4342劉麗娜，梁麗娜.炎癥性腸病與腸粘膜免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞.世界華人消化雜志.2021；28

21、.3Poltorak A , He X, Smirnova I , et a l . Defective LPS signaling in C3H / He J and C57BL / 10 ScCr mice: mutations in Tlr4 gene J .Science, 2021, 282 ( 4 ) : 2085-2088.4Morris GP,Beck PL, Herridge MS, et al.Hapten2inducedmodel ofchronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology 2021；96(3):795-803.5IukasiewiczJLugowski cBiologic activity of lipopolysaccharidesJPostepy Hig Med Dosw，2021，57(1)：33-536DAndrea A。AsteAmezaga MVajianle NM,et a1Intefleukin 10(IL-10)in