紫外線對枯草芽孢桿菌誘變

1、紫外線誘導枯草芽孢桿紫外線誘導枯草芽孢桿 菌突變菌突變 第六組小組成員第六組小組成員 實驗目的：實驗目的：學習微生物誘變育種的基本操作方法學習微生物誘變育種的基本操作方法實驗內(nèi)容：實驗內(nèi)容：1：對枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株進行處理：對枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株進行處理制備菌懸液。制備菌懸液。2：對紫外線進行誘變處理。：對紫外線進行誘變處理。實驗材料和用具1 菌種:枯草芽孢桿菌2 培養(yǎng)基:淀粉培養(yǎng)基。3 主要藥品:牛肉膏、蛋白胨、Nacl、可溶性淀粉、碘液，生理鹽水。4主要器皿:試管、移液管、錐形瓶、量筒、燒杯、紫外燈、離心機、培養(yǎng)皿等。技術路線：材料器具準備菌懸液制備平板制作紫外線誘變處理稀釋菌懸液稀釋涂

2、平板計算存活率及致死率操作步驟1.菌懸液制備將枯草芽孢桿菌接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h，使其活化，取已培養(yǎng)20 h 的活化枯草芽孢桿菌斜面一支，用10 mL 生理鹽水將菌苔洗下，倒入離心管中，離心(3000 r/min)15min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2 次，最后制成菌懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為108/mL。2. 平板制作將培養(yǎng)基熔化后，冷至45左右倒平板。3誘變處理用物理方法或化學方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定，有時還可采用復合處理，可獲得更好的結果。本實驗用紫外線照射的誘變方法。(1)紫外線處理 打開紫外燈預熱20mi

3、n。取5mL 菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿中，同時制作5 份。逐一操作，將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處，照射l min 后打開培養(yǎng)皿蓋，開始照射，與照射處理開始進行攪拌，即時計算時間，照射時間分別為15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，誘變菌液在黑暗中保存12h 然后稀釋涂菌進行初篩。(2)稀釋菌懸液 按10 倍稀釋至10-6，從10-5和10-6中各取出0.lmL 加入到酪素培養(yǎng)基平板中(每個稀釋度均做3 個重復)，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置，于30恒溫培養(yǎng)23d。4稀釋涂平板 取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5 mL 進行不同

4、程度的稀釋。取最后3 個稀釋度的稀釋液涂于淀粉培養(yǎng)基平板上，每個平板加稀釋液0.1 mL，用無菌玻璃刮棒涂勻，培養(yǎng)48 h(用報紙包好平板)。注意在每個平板背后要標明處理時間、稀釋度。注：枯草芽孢桿菌誘變前：稀釋至10-8，10-7,10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射1min稀釋至10-8,10-7,10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射2min稀釋至10-8,10-7，10-6，生理鹽水枯草芽孢桿菌照射3min稀釋至10-8，10 存活率將培養(yǎng)48 h 后的平板取出進行細胞計數(shù)。根據(jù)平板上菌落數(shù)，計算出對照樣品1 mL 菌液中的活菌數(shù)。 同樣計算用紫外線處理1、2、3min 后的存活細胞數(shù)及致死

5、率。注 意 事 項1：紫外線照射時注意保護眼睛和皮膚。2：誘變過程及誘變后的稀釋操作在無菌下進行并黑暗中培養(yǎng)。 實驗結果分析實驗結論：實驗失敗失敗原因分析：細節(jié)決定成敗1：制作牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基時，沒有調(diào)到合適的PH。2：培養(yǎng)基滅菌處理沒有處理好，導致雜菌沒有滅干凈。3：接種過程中由于在酒精燈上灼燒時間長且沒有完全冷卻就進行接種導致菌種被燙死。培養(yǎng)基培養(yǎng)時沒有長出實驗中所需菌落。失敗原因4：紫外線誘變過程及誘變后的稀釋操作沒有在無菌下進行，在黑暗中培養(yǎng)時間過短。5：涂平板時離酒精燈遠進，導致雜菌進入，最后菌落沒有長出，且其他雜菌生長旺盛。6：由于以上所有操作都應無菌操作進行，但實際操作沒有做到

6、無菌操作，最后導致平板上菌落較雜，分不清枯草芽孢桿菌菌落無法計數(shù)。教訓1：實驗操作提前準備：實驗操作提前準備 材料及器材。材料及器材。2：無菌操作時嚴格：無菌操作時嚴格 按照無菌操作按照無菌操作 技術操作。技術操作。3 3：紫外線誘變處：紫外線誘變處 理時注意黑暗理時注意黑暗 培養(yǎng)。培養(yǎng)。4：遇到不會的要：遇到不會的要及時詢問，不能及時詢問，不能自己隨便做。自己隨便做。參考文獻：參考文獻：1李豪，車振明.微波誘變微生物育種的研究J.山西食品工業(yè)，2005,6（2）.簡要概括了國內(nèi)外微波誘變育種領域的研究新進展，對微波的生物學效應及誘變微生物的機理進行了總結和討論，在此基礎上探討了微波誘變微生物

7、育種的應用性研究。最后，對本領域的發(fā)展進行了展望。2孫金旭.乳酒酵母紫外誘變原生質(zhì)體制備研究J.釀酒科技，2008（6）.在乳酒酵母原生質(zhì)體形成率和再生率影響單因素研究的基礎上，對菌齡、酵解溫度、酵解時間、酶濃度、穩(wěn)滲劑采用L16（4）5正交試驗，評價各因素的影響程度，得出適宜該菌原生質(zhì)體制備的條件。33周德明，馮友仁，梁帥周德明，馮友仁，梁帥. .木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶高產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶和錳過氧化物酶高產(chǎn)菌株的誘變育種菌株的誘變育種J.J.中國林業(yè)科技大學學報，中國林業(yè)科技大學學報，2009,102009,10（5 5）. .利用低能利用低能N N 注入，對產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶注入，

8、對產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶(Mnp)(Mnp)和錳過氧化物酶和錳過氧化物酶(Lip)(Lip)活力均較高的菌株活力均較高的菌株N1023N1023進行誘變，研究了不同能量和不同劑量進行誘變，研究了不同能量和不同劑量N+N+離離子誘變后菌株的存活率與突變率、突變菌株的產(chǎn)酶活力及遺傳穩(wěn)定子誘變后菌株的存活率與突變率、突變菌株的產(chǎn)酶活力及遺傳穩(wěn)定性結果表明：不同能量和不同性結果表明：不同能量和不同N N 離子劑量注入對菌株有顯著影響，離子劑量注入對菌株有顯著影響，誘變菌株誘變菌株Nlo23jNlo23j產(chǎn)產(chǎn)Mnp11LipMnp11Lip雙酶活力分別提高了雙酶活力分別提高了27272929和和222258

9、58，同時誘變菌株，同時誘變菌株N1o23jN1o23j有很好的遺傳穩(wěn)定性有很好的遺傳穩(wěn)定性。44孟慶云，張鵬孟慶云，張鵬. .環(huán)境參數(shù)變化對環(huán)境參數(shù)變化對射線誘變微生物的影響射線誘變微生物的影響J.J.微微生物學通報，生物學通報，2000,272000,27（3 3）. .報告了在非自然環(huán)境中培養(yǎng)選育青霉菌苗株的一些結論。實驗表明報告了在非自然環(huán)境中培養(yǎng)選育青霉菌苗株的一些結論。實驗表明隨著輻射劑量的增加菌株的致死率也相應增加；當輻照劑量相同時，隨著輻射劑量的增加菌株的致死率也相應增加；當輻照劑量相同時，與自然環(huán)境相比其致死率有所提高，且隨著非自然環(huán)境參數(shù)值的增與自然環(huán)境相比其致死率有所提高

10、，且隨著非自然環(huán)境參數(shù)值的增加而增加。當電場強度為加而增加。當電場強度為300kV300kVm m、磁場強度為、磁場強度為600G600G時，正變率有時，正變率有一極大值。一極大值。5婁權，陳廣平.浸礦微生物紫外誘變選育及浸礦機理研究J.現(xiàn)代礦業(yè)，2004（2）.通過微生物的銅離子耐受性培養(yǎng)，選取可以浸出銅離子的酸性浸礦微生物，并利用紫外線照射對微生物進行誘變培養(yǎng)，培育出一種可以高效浸出銅離子的酸性浸礦微生物。同時探討了微生物對銅離子的耐受性培育和紫外線誘變在高效浸礦微生物選育中的應用，以及浸礦微生物在礦山中的應用前景。6丁學知，夏立秋.蘇云金桿菌高毒力菌株4.0718的快速選育J.中國生物防

11、治，2001,17（4）63-166.不同生態(tài)區(qū)域的早作地、果園和稻田采集的858份土樣中，分離篩選出蘇云壘桿菌30株選取一株具典型蘇云壘桿菌菌落特征和較高殺蟲毒力的菌株70為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線和兩次亞硝基胍的交替復合誘變，顯微涂片染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)菌體的伴孢晶體的形狀、大小、數(shù)量及芽孢與伴孢晶體的比倒與殺蟲效力密切相關以這些特征為參考進行一佚速韌篩和毒力生測復篩，篩選出一株高毒力突變殺蟲菌株40718。該突變襪殺蟲毒力與原始菌株相比提高了75倍，在6、12和24h內(nèi)供試小菜蛾三齡幼蟲死亡率分別高達20、97和100此菌株的高效速效殺蟲毒力經(jīng)連續(xù)l0代培養(yǎng)能穩(wěn)定遺傳。7石磊，梁運章.物理因子對微生

12、物誘變作用的研究進展J.內(nèi)蒙古大學學報（自然科學版），2006,1（1）.微生物與食品衛(wèi)生、醫(yī)藥健康、生態(tài)環(huán)境、資源使用、農(nóng)畜牧業(yè)等方面息息相關。用于工業(yè)生產(chǎn)上的微生物主要是從自然界篩選或選育的，為了獲得優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、低耗的工業(yè)微生物，人們采用各種物理因子對微生物進行誘變處理的試驗研究，并獲得成功，其中有些經(jīng)誘變的微生物菌株應用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。介紹了近幾年人們用激光、電磁波、離子束等幾種物理因子對微生物進行處理得到的一些研究成果及基本機理分析。8賈嘯靜.微生物藥物產(chǎn)生菌誘變育種方法的應用和進展J.河北省科學院學報，2006,23（3）.產(chǎn)微生物藥物的原始菌株往往產(chǎn)量較低,為滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要,需要通過合適的誘變育種方法進行改良。詳細介紹了目前較為通用的幾種物理和化學誘變育種技術及其應用情況,同時簡述了獲得高產(chǎn)突變株的幾種篩選方式。9許翠，高夢祥.微生物菌種誘變篩選方法及其應用J.長江大學學報（自然科學版），