設(shè)計引物原則以及如何查找基因序列

1、引物設(shè)計原則:1 .找出這種細胞物種的PTN全長核昔酸序列2.采用primerpremier5.0軟件設(shè)計引物設(shè)計應(yīng)注意如下要點：1 .引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不應(yīng)大于38,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74,不適于TaqDNA聚合酶進行反應(yīng)2。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3'端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3'端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC也會使錯誤引發(fā)機率增加2。3 .引物3端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其

2、他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3'端使用堿基A34。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物2。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大25。5 .引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo軟件中使用的是最鄰近法(thenearestneighbormethod)67。6 .AG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)

3、定性。應(yīng)當選用3端AG值較低(絕對值不超過9),而5'端和中間AG值相對較高的引物。引物的3'端的AG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)6。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高(超過4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行8。8 .對引物的修飾一般是在5'端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。如果文獻上的這個基因跟你是同一物種來源的話是可以運用別人的引物看看他的引物是基因組的還是cDNA的。cDNA的可以直接用。基因組的就再看看了好的引物對實驗進程不會延緩我覺得

4、在涉及引物只要遵循以下的原則，一般是沒什么問題！我是從來不借助什么專業(yè)軟件來設(shè)計，按照自己的需要選取就是了，一般20bp,不浪費！到目前還沒有失敗過！引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：(1)引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。(2)引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度Tm=4(G+C)+2(A+T).(3)四種堿基應(yīng)隨機分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。(4)引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核甘酸對應(yīng)，以減少由

5、于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。(5)在引物內(nèi)，尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(6)兩引物之間尤其在3'端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。(7)引物5端對擴增特異性影響不大，可在引物設(shè)計時加上限制酶位點、核糖體結(jié)合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。(8)引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)，以免產(chǎn)生非特異性擴增，影響產(chǎn)量。（9）簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子，例如選用只有一種密碼子的Met,3,端應(yīng)不存在簡

6、并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計，可精確計算引物濃度，在1cm光程比色杯中,260nm下，引物濃度可按下式計算：Xmol/L=OD260/A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）X:引物摩爾濃度，A、C、G、T:引物中4種不同堿基個數(shù)。如何查找基因序列NC表示人類基因組DNA的RefSeq。（鏈接序列）NM表示mRNA的RefSeq。NP表示蛋白質(zhì)的RefSeq1 .根據(jù)文獻中已知的基因ID如果你在文獻中看到你感興趣的基因，而且文

7、中還提到了該基因在Genbank中的ID號，那就好辦了，直接打開http:,在Search后的下拉框中選擇Nucleotide,把GenbankID號輸入GO前面的文本框中，點“GO,就可以找到了。（如GenBankaccessionnumbergi16151096）”。2 .根據(jù)已經(jīng)獲得的基因的相關(guān)信息進行查找打開http:/在search后面的下拉框中選擇Gene,然后在中間的文本框中輸入基因名稱“VEGF，點擊GO搜索結(jié)果出來了，點擊箭頭所指的Limits,Limits的意思其實就是高級檢索，你可以在這里對檢

8、索詞進行很多限制，這樣能大大精簡查詢結(jié)果。我們接著來，在Limits這個界面，先選擇查詢白限定范圍：先選Genename（基因名稱）；然后再選擇LimitbyTaxonomy（生物分類限定）中的Homosapiens（人類），然后再點擊“GO。直接點擊基因名稱“VEGFA就可以看到有關(guān)基因的信息了。需要指出的是，在Genbank中，基因有很多別名（Aliases）,和Genbank中記錄的名稱有可能不一致。比如在這里，VEGFA!Genbank中記錄的基因名稱，而它還有很多別名，比如MGC70609,VEGF（這就是我們要找的基因名稱），VEGF-A,VPF;還有，在這里可以看到該基因在染色體

9、上的位置.再往下看，可以看至UGenomicregions,transcripts,andproducts,這里顯示了該基因在基因組中的位置，以及轉(zhuǎn)錄本的生成情況：就看見了目的基因的mRNA勺鏈接（如NM_001025366.1）和蛋白質(zhì)的鏈接（如NP_001020537.2）這里得說兩句，有的基因也許只有一個編碼序列，但有的基因有很多的mRN曲接體，但都是歸在一個基因名稱下面。比如，在VEGFI因下面有7個序列，分別是vascularendothelialgrowthfactorAisoforma,isoformc,isoformd,isoforme,isoformf,isoformg,is

10、oformbprecursor，但是哪個是自己想找的基因呢？這就需要根據(jù)你自己查閱的文獻以及在這些基因序列后面的解釋來確定了。如果我想找的基因是第一個序列即isoforma,就可以點擊NM_001025366.1,ncbi中查找基因序列的方法和三個號碼ncbi首頁，點擊左側(cè)Genes&Expression®入后，點擊中間頁面DATABASE里的GenBank,進入GenBank頁面。選CoreNuleotide。搜“SaccharomycescerevisiaetpS11 .例子：查找釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae里的海藻糖合成酶基因（tps1）Nj

11、hnd1；lhuXdFMudkiniNjII0I1L11llsLldUl陰口rJicjllllPubMedAllDatabasesBLASTOMIM日0口ksT聯(lián)日歸aStructureISearch|orgNucIgtid曰vforISacchmrumycwscgrewisiai曰3TL,v>r1>1小品乜“I''CtCrctL即可出現(xiàn)很多條目，找到Saccharomycescerevisiae的就是NC_001134了，點擊后就進入該基因所在染色體的界面了，再在“編輯”中“查找"tpsl就R以看該基因所在的位置，再點擊CDS或者GeneID:85242

12、3都可以出現(xiàn)相關(guān)鏈接！當然，如果你在文獻查到目的蛋白的序列號如NP009684.1或者GeneID:852423,那分別在Search后選擇Protein或者Gene也可以出現(xiàn)相關(guān)鏈接！2 .基因CDS區(qū)界面的3個號碼/entrez/viewer.fcgi?val=50593115&from=488899&to=490386&view=gbwithparts找到后，我發(fā)現(xiàn)該界面有3個標記，一個是NC_001134,其次是gi:50593115,最后是FEATURESgene中的/db_xref="GeneID

13、:852423”,他們分別是什么號碼，用在什么地方呢？嘗試中，終于發(fā)現(xiàn)，在Search"Nucleotide"或者"CoreNucleotide”時，for后面是NC_001134,最終go到該基因所在染色體全長序列的信息，所以NC_001134應(yīng)該是該染色體的后錄號吧？在Search"Nucleotide"或者"CoreNucleotide”時，for后面是50593115,最終go至U該基因所在染色體全長序列的信息，所以50593115應(yīng)該是該染色體的號吧？在Search“Gene”時，for后面是852423,最終go到該基因的

14、信息，所以852423應(yīng)該是該基因的登錄號吧？所以我們?nèi)绻涀∧康幕蛟趎cbi中的位置就記住這個一京eID!其他像NP_009684是基因編碼的蛋白質(zhì)的登錄號。文獻中查到的基因往往給的是GeneID三.引物設(shè)計第一步-我編碼序列的方法在Search“Gene”時，for后面是852423,最終go到目的基因的信息1:TPS1Ioftr«hal0-phatrrrfiphphwcmp修九which才工*1sth*制*口9。-carbohydrateInamombEtric：f&riii：艮pr*ih>n屋Inducedbyth*itrtf¥r噂p力力壬andr

15、«pr*iftdllbth«Rafl-cAfdlPpathway|jSunrinat?Cumiri49nwTPS1IPrlMai'y*sourc-fl-一iu.LueuiiLdrgggjgjggCJenetypeprntsnccdirgKef3eqstatusRByi白電心OrganlsntSxu2muangE1和aegmin:之黜CJLineage司Fuf?gi；Ascomycot內(nèi)ofisw;f口121rom¥亡國已植工；占比日相廿呼匕剪后匚b+t：AlsoknDm»TSS1,GLC6;MSI;FDP1;CVFl;B>,P1NC00li

16、34；7LinksNUCLEOTIDELINKS>FASTA卜GENBANK點擊中的FAST眩得的就是mRNA的非模板鏈（其實就是mRNA里的U換成了T）,也可以說是CDNA的互補片段，因為與編碼的蛋白質(zhì)一一對應(yīng)，所以也就是引物設(shè)計真正的模板！引物設(shè)計后面的PCR要克隆的就是這段序列！所以千萬不要搞錯了！點擊GENBANK獲得的是CDS區(qū)的序列和相關(guān)信息，這個CDS區(qū)包括CDNA,也包括其他不編碼的序列，所以PCR沒必要把CDS區(qū)全部克隆出來！其實在CDS界面（或者說點擊GENBANK后出現(xiàn)的界面里），把Display里的GENBANK（full）改成FAST他可以！其實在該界面中我們還可以了解到其他信息1 .點擊referencesequencedetails,可以看到NP009684.1,點擊他，可以看到目的蛋白質(zhì)的信息36個sgd漢甚型mmhmexternalMitochondrialribosomalproteinofthelargesubunit2 .點擊小3看詠獲得的是目的基因的圖譜，然后點擊十第4syprdlmmhmexternalSynthasesubunitoftrehalose-6-phosphatesynthase十s-d雙匹電mmhmexternalProteinofunknownfimction,overproductionblock