第七章 分離純化

1、 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化l預處理預處理（pretreatment）：包括固液分離和細胞：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。l初步純化初步純化（rough fractionation） （提取）：除（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。l高度純化高度純化（fine fractionation） （精制）：除（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。l濃縮與干燥濃縮與干燥（concentration and desiccation）（成品加工）（成品加工）: :使酶與溶劑分離的過程。使酶與溶劑分離

2、的過程。 第一節(jié)第一節(jié) 酶的分離酶的分離一、發(fā)酵液預處理一、發(fā)酵液預處理( (一一) )發(fā)酵液的相對純化發(fā)酵液的相對純化1. 1. 無機離子的去除無機離子的去除 2. 2. 雜蛋白質(zhì)的去除雜蛋白質(zhì)的去除3. 3. 色素及其他物質(zhì)的去除色素及其他物質(zhì)的去除( (二）發(fā)酵液的固液分離二）發(fā)酵液的固液分離1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素影響發(fā)酵液過濾的因素 l1）菌種）菌種l2）培養(yǎng)基組成）培養(yǎng)基組成2. 提高過濾性能的方法提高過濾性能的方法 1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚 2 2）稀釋、加熱）稀釋、加熱 3 3）加助濾劑，）加助濾劑，常用硅藻土等。常用硅藻土等。 二、細胞破碎二、細胞破碎 （一）（一）

3、細胞壁組成細胞壁組成 l細胞壁的主要成分：細胞壁的主要成分：l 細菌：肽聚糖細菌：肽聚糖(N-(N-乙酰萄糖胺，乙酰萄糖胺，N-N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸) )l 酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)l 真菌真菌: : 多糖（多糖（幾丁質(zhì)和葡聚糖幾丁質(zhì)和葡聚糖） l 微生微生物物 革蘭氏陽性革蘭氏陽性細菌細菌 革蘭氏陰性革蘭氏陰性細菌細菌 放線放線菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 同同G+100 300 100 250 層次層次 單層單層 多層多層 多層多層 多層多層 主要主要組成組成 肽聚糖肽聚糖(40% 90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸

4、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1%2%) 肽聚糖肽聚糖(5% 10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11% 22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30% 40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)(1% 2%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6% 8%)脂類脂類(8.5% 13.5%)多聚糖多聚糖(80% 90%)脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 細菌細胞壁的結(jié)構(gòu)細菌細胞壁的結(jié)構(gòu) 酵母菌細胞壁的結(jié)構(gòu)酵母菌細胞壁的結(jié)構(gòu) M甘露聚糖；甘露聚糖；P磷酸二酯鍵；磷酸二酯鍵；G葡聚糖葡聚糖 （二）細胞破碎的方法（二）細胞破碎的方法l 機械法機械法 l 物理法物理法l 化學法化

5、學法 l 生物法（酶解）生物法（酶解） l1.1.機械法：機械法：l 1 1）液體剪切：攪拌、勻漿。）液體剪切：攪拌、勻漿。l 2 2）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。）固體剪切：研磨，珠磨，搗碎。l2.2.物理法物理法：l 1 1）超聲波破碎法。）超聲波破碎法。l 2 2）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）滲透壓突變法：高滲（蔗糖，高鹽等）l 平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。平衡后迅速轉(zhuǎn)入低滲溶液或水中。l 3 3）凍融法：反復低溫冰凍，室溫融化。）凍融法：反復低溫冰凍，室溫融化。l3. 化學法化學法 應用各種化學試劑與細胞膜作用，應用各種化學試劑與細胞膜作用，使細胞膜結(jié)構(gòu)改變或破壞。使細胞膜結(jié)構(gòu)

6、改變或破壞。l 1 1）有機溶劑處理：）有機溶劑處理：破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用破壞膜磷脂結(jié)構(gòu)，常用l丙酮、丁醇、氯仿等丙酮、丁醇、氯仿等。l 2 2）表面活性劑處理：）表面活性劑處理：常用非離子型表面常用非離子型表面l活性劑，如活性劑，如Triton X-100Triton X-100，TweenTween等。等。l4.4.酶解法（酶解法（e enzymatic lysisnzymatic lysis）： l 外加酶法：外加酶法：l 根據(jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當?shù)拿父鶕?jù)細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成特點，選用適當?shù)拿?。l 自溶法（自溶法（a autolysisutolysis）: :l 細胞結(jié)構(gòu)在本身

7、具有的各種水解酶作用下發(fā)細胞結(jié)構(gòu)在本身具有的各種水解酶作用下發(fā) l生溶解的現(xiàn)象。生溶解的現(xiàn)象。l細胞細胞 聲波聲波 機械機械 滲透壓滲透壓 凍融凍融ll動植物動植物 + + + + + + +l革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 + + + + + + +l革蘭氏陽性芽孢菌革蘭氏陽性芽孢菌 + + + + + + +l酵母酵母 + + + + + + +l革蘭氏陽性球菌革蘭氏陽性球菌 + - + + - + +l菌絲菌絲 - + - +- + - +l孢子孢子 - - - -（三）細胞破碎確認（三）細胞破碎確認 1.1.直接測定破碎前后的細胞數(shù)直接測定破碎前后的細胞數(shù)： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器

8、直接計數(shù)；破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細胞與完整細胞。破碎后，用染色法區(qū)分破碎細胞與完整細胞。 2.2.測定導電率測定導電率： 利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。利用破碎前后導電率的變化測定破碎程度。 3.3.測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。估算破碎率。 三、酶的提取三、酶的提取(extraction)(extraction) l 把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放把酶從生物組織或細胞中以溶解狀態(tài)釋放出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量

9、少的雜出來的過程，即將盡可能多的酶，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。質(zhì)從原料中引入溶液。 l 提取目標：提取目標： a. 將將目的酶最大限度地溶解出來。目的酶最大限度地溶解出來。 b. 保持生物活性。保持生物活性。l注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，l一般一般采用低溫下（采用低溫下（0 0 1010）操作。操作。提取原則提取原則la. 相似相溶。相似相溶。lb. 遠離等電點的遠離等電點的pH值，溶解度增加。值，溶解度增加。 提取方法提取方法：（一）鹽溶液提?。ㄒ唬}溶液提取 常用稀鹽（常用常用稀鹽（常用NaClNaCl）溶液（鹽溶），）溶液（

10、鹽溶），對酶穩(wěn)定性好、溶解度大對酶穩(wěn)定性好、溶解度大 ，最常用。，最常用。 （二）酸、堿溶液提取（二）酸、堿溶液提?。ㄈ┯袡C溶劑提?。ㄈ┯袡C溶劑提取四、四、 離心分離離心分離（一）一）基本原理基本原理1. 1. 離心力離心力 Fc = m ac m r r 2 2 m r r （2 N/60）2 2 N為離心機為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）；）； Fc通常以相對離心力通常以相對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，即離心力）表示，即離心力F的大小相的大小相當于地球引力（重力常數(shù)當于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。）的多少倍。一般一般用用g

11、 g（或數(shù)字（或數(shù)字 g g）表示。）表示。RCF = RCF = m r r （2 N/60）2 2 /mg= 1.12 = 1.12 1010-5 -5 N2 2 r 此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系 旋轉(zhuǎn)半徑用旋轉(zhuǎn)半徑用r r平均平均代替代替 r r平均平均=1/2=1/2（r r大大+r+r小小）cmcm 通常：通常：低速離心以低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：表示，如：40004000r/minr/min。高速離心（超速），常以高速離心（超速），常以相對離心力相對離心力（RCFRCF）表）表 示，如：示，如：65000g65000

12、g。 兩者可換算或查測算圖。兩者可換算或查測算圖。計算近似計算近似RCF的列線圖的列線圖2. 沉降系數(shù)沉降系數(shù):（sedimentation constant） 指單位離心力下顆粒的沉降速度指單位離心力下顆粒的沉降速度（sedimentation velocity）, ,用用S表示表示。 由于許多生物大分子的由于許多生物大分子的S S值很小，所以定值很小，所以定義義10 10 13 s 為一個沉降單位，為一個沉降單位，1S = 1 10 13 s。 常用常用S表示某些生物大分子、亞細胞及亞表示某些生物大分子、亞細胞及亞細胞器的大小，如細胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系，蛋白質(zhì)的沉降系

13、數(shù)一般在數(shù)一般在1 200之間。之間。 （二）離心機的種類（二）離心機的種類 按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為：按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 名稱名稱 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速(r/min)(r/min) 注意事項注意事項 低速離心機低速離心機 60006000 常溫，注意樣品熱變性和常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡離心管平衡 高速離心機高速離心機 6000 25000冷凍（防止溫度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機超速離心機 25000冷凍真空系統(tǒng)（減少空冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精

14、確平衡 離心機的種類離心機的種類 l溫度類型：溫度類型：常溫及常溫及冷凍冷凍l超速離心機均為冷超速離心機均為冷凍型。凍型。l使用冷凍離心機時使用冷凍離心機時提前降溫，預冷離提前降溫，預冷離心頭。心頭。l使用超速離心機時使用超速離心機時先抽真空。先抽真空。l角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式及外擺式：外擺式一般為低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。l材質(zhì)：玻璃，材質(zhì)：玻璃，塑料塑料l強度：和離強度：和離心速度相配心速度相配l大?。汉娃D(zhuǎn)大小：和轉(zhuǎn)子配套子配套l高

15、速超速管高速超速管要加蓋要加蓋l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。（三）常用離心方法（三）常用離心方法 差速離心法差速離心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度離心密度梯度離心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度離心等密度梯度離心1差速離心差速離心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法度不同的顆粒分批分離的方法。特點：特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點：優(yōu)點：操作

16、簡單操作簡單 。缺點：缺點：1）分離效果較差，分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。不能一次得到純顆粒。 2）壁效應嚴重。）壁效應嚴重。 3 3）沉降的顆粒受到擠壓）沉降的顆粒受到擠壓。 差速離心分離示意圖差速離心分離示意圖 （a a）離心前的懸浮液）離心前的懸浮液 （b b）（）（e e）離心不同時間后顆粒的沉降情況）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2密度梯度離心密度梯度離心 （density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation） 樣品在樣品在密度梯度介質(zhì)密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以

17、分離的一種區(qū)帶降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。分離方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗糖溶液。溶液。特點：特點：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì) 顆粒的密度。顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì)物質(zhì)。 密度梯度離心示意圖密度梯度離心示意圖 （a a）離心前）離心前 （b b）離心后）離心后 Density gradient ultracentrifugation 步驟：步驟： A.形成密度梯度形成密度梯度 B. 加樣加樣 C.離心離心 D.收集樣品收集樣品3. 等密度梯度離心等密度梯

18、度離心 又稱又稱沉降平衡離心沉降平衡離心 （sedimentation sedimentation equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根據(jù)根據(jù)顆粒的密度不同顆粒的密度不同而進行分離。而進行分離。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。區(qū)帶。 常用常用氯化銫氯化銫（CsClCsCl）作為梯度介質(zhì)。）作為梯度介質(zhì)。特點：特點： 介

19、質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。的物質(zhì)。 等密度梯度離心示意圖等密度梯度離心示意圖 （a a）離心前；）離心前； （b b）離心后）離心后 密度梯度離心密度梯度離心等密度梯度離心等密度梯度離心梯度梯度介質(zhì)介質(zhì)通常用蔗糖通常用蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度密度密度最大的沉降樣品最大的沉降樣品離心離心條件條件在最前的沉降物質(zhì)達在最前的沉降物質(zhì)達到管底前停止，短時到管底前停止，短時間，低速度間，低速度使各組分沉降到其平衡使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高的密度區(qū)，長時

20、間，高速度速度分離分離依據(jù)依據(jù)密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系數(shù)不同數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度沉降系數(shù)相近，但密度不同不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點沉降速度離心和沉降平衡離心的特點總結(jié)總結(jié)：等密度梯度離心等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度是一種測定顆粒浮力密度的靜力學方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，的靜力學方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。使之包括待分離物的密度范圍。差速離心差速離心是一種動力學方法，關(guān)鍵在于選是一種動力學方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點，兼有以上兩種方法的特點，

21、關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。（四）應用（四）應用 根據(jù)不同離心目的，分為根據(jù)不同離心目的，分為制備性離心：制備性離心： 分離純化和制備分離純化和制備分析性離心：分析性離心： 測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度測分子量、沉降系數(shù)、密度、純度五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）使溶液中的溶質(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀鍪谷芤褐械娜苜|(zhì)由液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔辔龀龉爬稀嵱?、簡單的初步分離方法古老、實用、簡單的初步分離方法l在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：l 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法）l 有機溶劑

22、沉淀有機溶劑沉淀l 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）l 等電點沉淀等電點沉淀l 有機聚合物沉淀有機聚合物沉淀（一）鹽析沉淀法（改變離子強度）（一）鹽析沉淀法（改變離子強度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析）基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶鹽溶（salting insalting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析鹽析（salting outsalting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高濃度的

23、中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度離子強度 原因：原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域和荷電區(qū)域 l1）中性鹽的選擇）中性鹽的選擇l 常用（常用

24、（NH4）2SO4，其突出優(yōu)點：，其突出優(yōu)點：l a. 溶解度大溶解度大l b. 分離效果好分離效果好l c. 不易引起變性不易引起變性l d. 價格便宜價格便宜l2. 鹽析用鹽鹽析用鹽2) 鹽濃度的表示鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示用飽和（溶解）度表示: 溶液中飽和硫酸銨的體積溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度飽和度 溶液的總體積溶液的總體積3) 調(diào)整鹽濃度的方式調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃度又不太高時。度又不太高時。 配制飽和硫酸銨溶液配制飽和硫酸

25、銨溶液所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算：所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2-S1 V=V0 1-S2式中式中 V,V0分別為所需加入的飽和硫酸銨分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積體積及原溶液體積S2,S1分別為所需達到的硫酸銨飽和度和分別為所需達到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度原來溶液的硫酸銨飽和度b. 添加固體硫酸銨添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達到的鹽濃度又很高時。達到的鹽濃度又很高時。按下式計算，得表中數(shù)據(jù)按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2-S1)W= 1-AS2A,B常數(shù)，與溫度有關(guān)。常數(shù)，與溫

26、度有關(guān)。 實際使用時，可直接查表實際使用時，可直接查表 （各種飽和度下（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。需加固體硫酸銨的量）。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表表l低飽和度：低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過終飽和度不超過4040。l高飽和度：高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。l1 1）固體硫酸銨充分研細，溫和攪拌中緩慢加入。）固體硫酸銨充分研細，溫和攪拌中緩慢加入。l2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。）放置過夜，待沉淀完全后高速離

27、心。l3 3）沉淀再溶解后可用超濾）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltrationultrafiltration） 、透、透析析（dialysisdialysis）或?qū)游龌驅(qū)游觯╟hromatographychromatography）方法脫鹽。方法脫鹽。 3. 鹽析曲線的制作鹽析曲線的制作 l 如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應先確定沉淀該如要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，應先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。物質(zhì)的硫酸銨飽和度。 蛋白質(zhì)量蛋白質(zhì)量(mg)或酶活力或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨 飽和度 硫酸銨濃度（硫酸銨濃度（% %） 枯草桿菌枯草桿菌

28、- -淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 l4. 鹽析的影響因素鹽析的影響因素l1) 離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)）離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)） 蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：IKSSs0loglogI I：離子強度，：離子強度，I = MZI = MZ2 2；M M：離子濃度（：離子濃度（mol/Lmol/L）；）； Z Z：離子價數(shù)：離子價數(shù)S S：離子強度為：離子強度為I I時的蛋白質(zhì)的溶解度（時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/Lg/L）S S0 0：離子強度為：離子強度為0 0時蛋白質(zhì)的溶解度（時蛋白質(zhì)的溶解度（g/Lg/L）KsKs：鹽析常數(shù)，是與

29、：鹽析常數(shù)，是與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和和鹽種類鹽種類有關(guān)的特性常數(shù)。有關(guān)的特性常數(shù)。 KsKs代表鹽析效率代表鹽析效率 ，其含義是隨著鹽濃度的增加，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，K Ks s越大鹽析效果越好。越大鹽析效果越好。 當溫度一定時，當溫度一定時，S S0 0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用用表示，鹽析方程式可改寫為：表示，鹽析方程式可改寫為： log S = - Klog S = - Ks s I I 兩種鹽析法：兩種鹽析法：Ks分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定的在一定的pH和溫度條件下，和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同

30、，通過改變離子強的不同，通過改變離子強度或鹽濃度（即改變度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。值）的沉淀方法。分級鹽析法分級鹽析法 ：在一定離子強度下，通過改在一定離子強度下，通過改變?nèi)芤旱淖內(nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法及溫度的沉淀方法。l2) 蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度：l 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。 l3) pH值：值：等電點處最易沉淀。等電點處最易沉淀。l4) 溫度的影響：溫度的影響：l稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。l濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。濃鹽溶液中，溫度升

31、高蛋白質(zhì)溶解度下降。l 一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。（二）（二） 有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）l 利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。不同而使之分離的方法。l1. 沉淀機理沉淀機理l 降低溶液的介電常數(shù)降低溶液的介電常數(shù)l 部分地引起蛋白質(zhì)脫水部分地引起蛋白質(zhì)脫水l2. 常用有機溶劑常用有機溶劑l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般為酶液體積甲醇，用量一般為酶液體積的的2 2倍左右，終濃度為倍左右，終濃度為70%70%。 l3.優(yōu)缺點：

32、優(yōu)缺點：l 優(yōu)點優(yōu)點：1）分辨率比鹽析法高分辨率比鹽析法高l 2） 沉淀不需脫鹽沉淀不需脫鹽l 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心l缺點：缺點：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活）容易引起蛋白質(zhì)變性失活l2)2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 l l4. 影響有機溶劑沉淀的因素影響有機溶劑沉淀的因素（1 1）溫度）溫度 ：低溫（低溫（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：盡可能靠近其等電點。盡可能靠近其等電點。 （3 3）離子強度：）離子強度：采用采用 0.05mol/L0.05mol/L的稀鹽溶液的稀鹽溶液 增加蛋白質(zhì)在有機溶劑

33、中的溶解度增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度 目的目的 防止蛋白質(zhì)變性防止蛋白質(zhì)變性 （4 4）蛋白質(zhì)濃度：）蛋白質(zhì)濃度：適當，一般為適當，一般為5 52020mg/ml mg/ml （三）（三） 等電點沉淀等電點沉淀(isoelectric(isoelectric precipitation) precipitation) l1.原理原理l 蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低l 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點 l2. 使用方法使用方法l 單獨單獨使用使用較少（較少（用于從粗酶液中除去某些等電用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白）點相距較大的雜蛋

34、白），多與其它方法聯(lián)合使用，多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在等電點時在等電點時仍有一定的溶解度。仍有一定的溶解度。l3. 優(yōu)點：優(yōu)點：l 1）大多數(shù)蛋白質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)都在偏酸性范圍內(nèi)l 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低l 3）無需除掉多余酸即可進行下一步純化）無需除掉多余酸即可進行下一步純化l4. 缺點：缺點：l 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活l （四）有機聚合物沉淀法（四）有機聚合物沉淀法 1. 作用機理：作用機理： 與有機溶劑類似與有機溶劑類

35、似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。，是發(fā)展較快的一種新方法。2. 沉淀劑：沉淀劑：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyene glycol，簡寫，簡寫 PEGPEG ） 多用分子量為多用分子量為600020000的的 PEG。3. 優(yōu)點：優(yōu)點：l操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。l沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當即可沉淀相當 l 多的生物大分子。多的生物大分子。l沉淀后有機聚合物容易去除。沉淀后有機聚合物容易去除。l（五）選擇性變性沉淀法（五）選擇性變性沉淀法l 選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變選擇一定的條件

36、使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 l 熱變性熱變性l 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。l pH變性變性l 等電點沉淀法是等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。變性法中的一種變體。l 有機溶劑變性有機溶劑變性l 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。六、萃取（六、萃取（extraction）分離分離 利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配

37、系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。的方法。l特點：特點：l1）比化學沉淀法分離程度高）比化學沉淀法分離程度高l2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快l3）比蒸餾法能耗低）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法（一）溶劑萃取法 明確幾個概念：明確幾個概念：料液：料液：供提取的溶液。供提取的溶液。 溶質(zhì)：溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)料液中欲提取的物質(zhì) 。萃取劑萃取劑 ：用來進行萃取的溶劑，通常是有機溶劑用來進行萃取的溶劑，通常是有機溶劑 。萃取液萃取液 ：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液萃取

38、劑形成的溶液 。萃余液：萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液被萃取出溶質(zhì)后的料液 。反萃?。ǚ摧腿。╞ack extractionback extraction）：）：完成萃取操作后，完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 l溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。）為基礎(chǔ)。l 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩互不相溶的溶劑里，達到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。相中的濃度比為一常數(shù)。l 萃取相濃度萃取相濃度 C1l

39、分配系數(shù)分配系數(shù) K K0 0 = = l 萃余相濃度萃余相濃度 C2l K K0 0值隨溶液值隨溶液pHpH的變化甚大，這是用萃取的變化甚大，這是用萃取法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。l 普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離，普通有機溶劑萃取難以進行蛋白質(zhì)的分離， l 因為因為:l1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑l2） 蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。分子生物物質(zhì)的提取。 萃取操作的萃取操作的3 3個步驟：個步驟： 1）混合）混合 2）分

40、離）分離 3）溶劑回收）溶劑回收l單級萃取單級萃取l 使用一個混合器和一個分離器使用一個混合器和一個分離器l 單級萃取流程單級萃取流程93（二）（二） 雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)l 又稱水溶液兩相分配技術(shù)又稱水溶液兩相分配技術(shù)l（partionpartion of two aqueous phase system of two aqueous phase system） l 用兩種不相溶的親水性高分子聚用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡）和葡聚糖（聚糖（DextranDextran）進行萃取。由于形成）進行萃取。由于形成的兩相均有很

41、高的含水量（達的兩相均有很高的含水量（達70%70%90%90%），故稱），故稱“雙水相雙水相”系統(tǒng)。系統(tǒng)。 l優(yōu)點：優(yōu)點：l1 1）每一水相中均有很高的含水量，為每一水相中均有很高的含水量，為 l酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；l2 2）PEGPEG、DextranDextran和無機鹽對酶等無毒和無機鹽對酶等無毒l害作用，不會引起變性。害作用，不會引起變性。 1.雙水相的形成：雙水相的形成： 兩種不同水溶性聚合物濃度達到兩種不同水溶性聚合物濃度達到一定值時，體系會自然地分成互不相一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。容的兩相，構(gòu)成雙水

42、相體系。 a雙節(jié)線系線b雙節(jié)線均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線臨界點PEG/DxPEG/Dx和和PEG/KPiPEG/KPi系統(tǒng)的典型相圖系統(tǒng)的典型相圖l 幾種典型的雙水相系統(tǒng)幾種典型的雙水相系統(tǒng)l聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇l 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l 羥丙基葡聚糖羥丙基葡聚糖l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l硫酸葡聚糖鈉鹽硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇l羧基甲基葡聚糖鈉鹽羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素甲基纖維素l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 磷酸鉀、磷酸鉀、硫酸銨硫酸銨l 硫酸鈉、硫酸硫酸鈉、硫酸鎂鎂2. 萃取原理：萃取原理：

43、利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。選擇性分配。l3. 應用應用l 胞內(nèi)酶的提取和精制胞內(nèi)酶的提取和精制: l 除去細胞碎片，并使酶得到純化。除去細胞碎片，并使酶得到純化。l l 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例 酶酶 菌菌 種種 相系統(tǒng)相系統(tǒng)l延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽鹽l天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l亮氨酸脫氫酶亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp. PEG/Dexl乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶 Bakers y

44、east PEG/ 鹽鹽l青霉素?；盖嗝顾仵；?E. coli PEG/ 鹽鹽 雙水相萃取法的重要研究方向雙水相萃取法的重要研究方向 親和萃取（親和分配親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（使用具有生物特異性的配基（ligandligand）來提高分離選擇性。來提高分離選擇性。 親和萃取酶實例親和萃取酶實例蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脫氫酶甲酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料l（三）（三） 超臨界流體萃取超臨界流體萃取l 兼有蒸餾和溶液萃取的特征，兼有蒸餾

45、和溶液萃取的特征，與常與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。萃取劑。 l 超臨界流體超臨界流體(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超過氣液共存時的最高壓力和：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點最高溫度下物質(zhì)特有的點臨界點后臨界點后的流體的流體。 臨界點的概念臨界點的概念可用臨界溫度和臨界可用臨界溫度和臨界壓力解釋：壓力解釋：l臨界溫度：臨界溫度：高于此溫度時，無論加壓高于此溫度時，無論加壓多大也不能使氣體液化。多大也不能使氣體液化。l臨界壓力：臨界壓力：在臨界溫度下，液化氣體在

46、臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。所需要的壓力。l lSCF性質(zhì)性質(zhì)介于液體和氣體之間介于液體和氣體之間 ：l1) SCF密度接近于液體，溶解度高。密度接近于液體，溶解度高。l2) SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體，粘度和擴散系數(shù)接近于氣體，l 傳質(zhì)擴散快傳質(zhì)擴散快。l基本過程：基本過程：l1）在）在SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于中，溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。分開。l2）降低壓力，使）降低壓力，使SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。取物與溶劑分離。l常用超臨界液態(tài)常用超臨

47、界液態(tài)CO2作為萃取劑，作為萃取劑， l 因為：因為：l1）液體）液體CO2無毒無毒l2）臨界溫度（）臨界溫度（304.06K）接近常溫）接近常溫l3）臨界壓力（）臨界壓力（7.38MPa）較低）較低l4）操作安全）操作安全l超臨界超臨界CO2萃取技術(shù)在生物、食品萃取技術(shù)在生物、食品l等工業(yè)中的應用等工業(yè)中的應用l CO2萃取部分產(chǎn)品萃取部分產(chǎn)品l原料名稱原料名稱 產(chǎn)物名稱產(chǎn)物名稱 原料名稱原料名稱 產(chǎn)物名稱產(chǎn)物名稱l小麥胚芽小麥胚芽 胚芽油胚芽油 豆子豆子 豆油精煉油豆油精煉油l啤酒花啤酒花 啤酒花精油啤酒花精油 茉莉花茉莉花 凈油凈油l辣椒辣椒 辣椒紅色素辣椒紅色素 菊花根菊花根 除蟲菊酯

48、除蟲菊酯l當歸當歸 精油精油 紫草紫草 紫草寧紫草寧l銀杏葉銀杏葉 銀杏內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯 花生花生 精煉精煉油油（四）（四） 反膠團萃取反膠團萃取l1. 反膠團：反膠團：又稱反膠束（又稱反膠束（Reversed Micelles）l 指指表面活性劑表面活性劑（由親水的極性基團和疏水由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù)的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù)有機有機 溶溶劑劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體。 反膠團模型反膠團模型親水基團向內(nèi)聚集親水基團向內(nèi)聚集（正）膠束（正）膠束反膠束反膠束形成形成 表面活性劑溶于水，表面活性劑溶于水，使其濃度

49、超過臨界使其濃度超過臨界膠束濃度。膠束濃度。表面活性劑溶于非極表面活性劑溶于非極性溶劑，使其濃度超性溶劑，使其濃度超過臨界膠束濃度。過臨界膠束濃度。構(gòu)造構(gòu)造 表面活性劑極性基表面活性劑極性基團在外，非極性基團在外，非極性基團在內(nèi)，形成非極團在內(nèi)，形成非極性核心。性核心。表面活性劑非極性基表面活性劑非極性基團在外，極性基團在團在外，極性基團在內(nèi)，形成極性核心，內(nèi)，形成極性核心，溶于水后，形成水池溶于水后，形成水池（ water pool ）。）。功能功能 溶解非極性物質(zhì)溶解非極性物質(zhì)溶解極性物質(zhì)溶解極性物質(zhì)lp154 2. 萃取過程萃取過程第一步：第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。將酶從水相

50、中萃取到反膠束相中。第二步：第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。 反膠團萃取原理反膠團萃取原理 3. 表面活性劑及有機溶劑表面活性劑及有機溶劑l 反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。l（1）表面活性劑）表面活性劑l 常用：常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活（陰離子表面活性劑，琥珀酸性劑，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸鈉）乙基己基酯磺酸鈉）。l特點：特點：易獲得，強度好；極性基團小，形成的易獲得，

51、強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進入。進入。 l（2） 非極性有機溶劑非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 l4. 優(yōu)點優(yōu)點l1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。l2）分離濃縮同時進行，溶劑可反復利用。）分離濃縮同時進行，溶劑可反復利用。l3 3）解決胞內(nèi)酶在非細胞環(huán)境中迅速失活問題。解決胞內(nèi)酶在非細胞環(huán)境中迅速失活問題。l4）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接從完整細胞提取酶蛋白。l5）成本）成本低。低。 第二節(jié)第二節(jié) 酶的精制酶的

52、精制 酶純化的基本原則：酶純化的基本原則：建立一個方便靈敏的分析方法；建立一個方便靈敏的分析方法；選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；常在低溫（常在低溫（44）條件下進行純化，以避免酶的）條件下進行純化，以避免酶的變性。變性。 一、膜分離一、膜分離 借助一定孔徑的高分子薄膜，將借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿硬煌笮?、形狀、性質(zhì)的顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)。進行分離的技術(shù)。（一）（一） 擴散膜分離擴散膜分離 透析透析（dialysis）溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子Y 從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動蛋

53、白質(zhì)透析蛋白質(zhì)透析 1. 透析膜透析膜 商品透析膜大多制成管狀商品透析膜大多制成管狀 。 材料：纖維素衍生物。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預處理：）透析膜的預處理：目的：目的：除雜質(zhì)。除雜質(zhì)。 2）透析袋的保存）透析袋的保存 ：防腐劑冷藏。防腐劑冷藏。2. 透析方法及裝置透析方法及裝置 透析袋透析簡單裝置。透析袋透析簡單裝置。A:A:透析夾，透析夾，B:B:透析，透析，C:C:透析示意圖透析示意圖 （二）加壓膜分離（二）加壓膜分離 根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同，分為：截留顆粒截留顆粒直徑直徑操作壓力操作壓力應用應用微濾微濾0.22 m0.1MPa除菌除菌超

54、濾超濾20A 0.2 m 0.1 0.7MPa 分離病毒及分離病毒及生物大分子生物大分子反滲透反滲透20A0.7 13MPa純水制備純水制備微濾微濾( (MicrofiltrationMicrofiltration，MF)MF) 一種靜態(tài)過濾，隨過一種靜態(tài)過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；直至微孔全被堵塞；無流動操作滲透液原料液超濾超濾 (ultrafiltrationultrafiltration，UFUF ) 一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表一種動態(tài)過程，由泵提

55、供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。的切向力，把膜面截流物沖掉。 超濾原理的示意圖超濾原理的示意圖 u利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。留，而小分子及溶劑濾過的方法。u超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應用。中有廣泛的應用。常規(guī)過濾常規(guī)過濾(A)(A)和超濾和超濾(B)(B)的示意圖的示意圖 A AB圖圖4

56、-61 超濾濃縮裝置超濾濃縮裝置 反滲透反滲透（Reverse osmosisReverse osmosis，RORO） 半 透 膜圖 14-3 利用反滲透膜選擇利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑性地只能透過溶劑( (通通常是水常是水) )的性質(zhì)，對溶的性質(zhì)，對溶液施加壓力，使溶劑通液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。分離出來的過程。滲透與反滲滲透與反滲透透Reverse Osmosis (RO)Nanofiltration (NF)Ultrafiltration (UF)Microfiltration (MF)Membrane Filtration3.

57、電場膜分離電場膜分離（1）電滲析：）電滲析： 在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負電極。在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負電極。（2）離子交換膜電滲析：）離子交換膜電滲析： 用離子交換膜代替一般的半透膜。用離子交換膜代替一般的半透膜。 應用：應用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。l 層析法也稱色譜法，是層析法也稱色譜法，是19031903年俄國年俄國植物學家植物學家Michael TswettMichael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有將植物色素溶液通過裝有CaCOCaC

58、O3 3 吸附劑吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。被分開。l 色譜起源色譜起源色譜色譜組分色素石油醚石油醚碳酸鈣顆粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和圖譜（）和圖譜（graphsgraphs）組）組成色譜一詞（成色譜一詞（Chromatography) Chromatography) 。l 利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和

59、固力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。動而達到分離的目的。：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：靜止不動的一相：靜止不動的一相 流動相有兩種狀態(tài)：流動相有兩種狀態(tài)： * *液體作為流動相液體作為流動相 * *氣體作為流動相氣體作為流動相 固定相也有兩種狀態(tài)：固定相也有兩種狀態(tài)： * *固體吸附劑作為固定相固體吸附劑作為固定相 * *以吸附在固體上的液體作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相 按兩相所處的狀態(tài)分類：按兩相所處的狀態(tài)分類： 液相層析液相層析 液液- -固層析固層析

60、 液液- -液層析液層析 氣相層析氣相層析 氣氣- -固層析固層析 氣氣- -液層析液層析l 按層析過程的機理分類：按層析過程的機理分類：吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。能的差異。分配層析分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。和力的不同。凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。組分阻滯作用的不同。 按操作形式不同分