中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)

1、中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)2022年3月21日背景病原學(xué)診斷始終是感染性疾病診斷中最重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷是臨床醫(yī)師根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出一系列鑒別診斷，然后針對(duì)這些進(jìn)行 檢 測(cè) ， 通 常 一 項(xiàng) 檢 測(cè) 只 能 對(duì) 應(yīng) 一 種 病 原 體 ， 而 宏 基 因 組 學(xué) 第 二 代 測(cè) 序 （ m e t a genomics next generation sequencing，mNGS）技術(shù)檢測(cè)能覆蓋更廣范圍的病原體。宏基因組測(cè)序技術(shù)（mNGS）因其覆蓋度廣、特異性好等特點(diǎn)越來(lái)越多地被應(yīng)用于臨床感染性疾病的精準(zhǔn)診斷，但因一直沒(méi)有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)而無(wú)法在臨床

2、進(jìn)行更為規(guī)范化的開(kāi)展。中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)2020年11月15日，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院張文宏教授作為通訊作者、艾靜文博士作為執(zhí)筆秘書(shū)在中華傳染病雜志發(fā)表了“中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)”。該共識(shí)就第二代測(cè)序技術(shù)的臨床應(yīng)用范圍、樣本采集、分析解讀和診斷效能等進(jìn)行了證據(jù)總結(jié)，給出27條推薦意見(jiàn)首次針對(duì)不同感染癥候群、不同病原體的適應(yīng)范圍給出了相應(yīng)的推薦意見(jiàn)，并在共識(shí)中多次強(qiáng)調(diào)質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)量的重要性。目錄CONTENTS臨床需求與應(yīng)用范圍1流程與質(zhì)量控制2結(jié)果的臨床應(yīng)用建議及其臨床判讀、驗(yàn)證3針對(duì)不同病原體類(lèi)型的診斷效能4在成

3、本經(jīng)濟(jì)效益分析下的臨床應(yīng)用推薦5第一節(jié)mNGS臨床需求與應(yīng)用范圍證據(jù)強(qiáng)度和證據(jù)質(zhì)量的分級(jí)定義證據(jù)強(qiáng)度： 為強(qiáng)烈推薦 為推薦，但其他替代方案也可接受 為推薦強(qiáng)度低，尋求替代方案為從不推薦證據(jù)質(zhì)量：為證據(jù)來(lái)自隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)為證據(jù)來(lái)自非隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)為證據(jù)僅來(lái)自專(zhuān)家意見(jiàn)。臨床需求推薦意見(jiàn)1：若懷疑細(xì)菌、真菌、DNA病毒、寄生蟲(chóng)、不典型病原體感染且需進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)時(shí)，建議采用DNA檢測(cè)；若懷疑RNA病毒感染時(shí)，則建議采用RNA法檢測(cè)（A,）:p 覆蓋范圍廣：二代測(cè)序檢測(cè)能覆蓋較大范圍的病原體，病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)都能被同時(shí)檢測(cè)，不論臨床樣培養(yǎng)成功與否，只要含有可檢測(cè)到的DNA 或RNA即可。p 周期

4、短：從接收樣本至完成數(shù)據(jù)分析，二代測(cè)序的周轉(zhuǎn)時(shí)間根據(jù)測(cè)序技術(shù)、方法和生物信息學(xué)分析方法的不同而不同，已有報(bào)道為6h 至7d不等（平均48h)臨床需求推薦意見(jiàn)2：對(duì)于臨床疑似感染的病重、病?；蛎庖咭种?、免疫缺陷的感染患者，建議在完善傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室及分子生物學(xué)檢測(cè)的同時(shí)，采集疑似感染部位的標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序（B,）p 臨床疑難雜癥或免疫抑制患者：二代測(cè)序在感染性疾病診斷領(lǐng)域中的優(yōu)勢(shì)在于其能檢測(cè)到其他傳統(tǒng)手段無(wú)法檢測(cè)到的病原體。因此，二代測(cè)序可能在應(yīng)用于臨床疑難雜癥或免疫抑制患者時(shí)有更大意義。p 排除檢測(cè)：二代測(cè)序也被報(bào)道可用于“排除”檢測(cè)，即檢測(cè)陰性有助于排除感染性疾病的診斷，但前提條件是測(cè)序覆蓋度足夠

5、高，能確保樣本中存在的病原微生物被檢測(cè)出p 病原體的耐藥基因檢測(cè)、醫(yī)院感染控制的監(jiān)測(cè)，以及社區(qū)傳染性疾病暴發(fā)的監(jiān)測(cè)：通常需要極高的覆蓋深度疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)3：急性感染對(duì)于懷疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時(shí)同步留取2mL腦脊液標(biāo)本保存于-1620冰箱。在完成常規(guī)生物化學(xué)檢查和培養(yǎng)之后，若3d內(nèi)未獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效，推薦對(duì)留存腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本（A,）。推薦意見(jiàn)4：病毒感染對(duì)于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的患者，如有條件，推薦在抽取腦脊液時(shí)同步留取2mL 腦脊液標(biāo)本保存于-1620冰箱。在傳

6、統(tǒng)PCR分子檢測(cè)（包括多重探針?lè)肿覲CR方法）后若未能獲得明確的病原學(xué)依據(jù)，推薦對(duì)留存腦脊液標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本（A,）。推薦意見(jiàn)5：需隨訪病原學(xué)證據(jù)對(duì)于慢性中樞神經(jīng)感染及需要隨訪病原學(xué)證據(jù)的患者，可首選二代測(cè)序進(jìn)行檢測(cè) （A,）。疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的適用范圍p 提高檢測(cè)率：目前，在常見(jiàn)病原體之外，二代測(cè)序在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中已成功檢測(cè)到多種新發(fā)及少見(jiàn)病原體，如羊布魯菌、星狀病毒、熱帶假絲酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等對(duì)于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的患者，二代測(cè)序檢測(cè)罕見(jiàn)、少見(jiàn)病原體的能力可顯著提高患者病原學(xué)確診的概率。在一項(xiàng)針對(duì)結(jié)核性腦膜炎患者的隊(duì)列研究中，二代測(cè)序被

7、證實(shí)可提高患者的病原體檢出率p 病原體載量動(dòng)態(tài)變化：對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染進(jìn)展的臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，主要以臨床表現(xiàn)、腦脊液常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和腦脊液培養(yǎng)為指在某些情況下的特異性免疫試驗(yàn)如隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)，可間接監(jiān)測(cè)病原體的載量情況。由于二代測(cè)序可檢測(cè)病原體及其匹配的序列數(shù)，所以能直接并結(jié)合宿主內(nèi)標(biāo)背景值半定量地顯示病原菌載量的動(dòng)態(tài)變化臨床疑似血流感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)6：常規(guī)檢測(cè)陰性對(duì)于懷疑血流感染的患者，如有條件，推薦在抽取血培養(yǎng)標(biāo)本時(shí)同步留取2mL血標(biāo)本，分離血漿后保存于-1620冰箱，血培養(yǎng)3d未報(bào)陽(yáng)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效時(shí)，推薦對(duì)留存血標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)。若未留存標(biāo)本，可重新采集標(biāo)本（A

8、,）。 推薦意見(jiàn)7：繼發(fā)性血流感染對(duì)于懷疑繼發(fā)性血流感染的患者，在原發(fā)感染灶的病原學(xué)檢測(cè)陰性或因各種因素?zé)o法送檢合適標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)的情況下，可考慮將血標(biāo)本的二代測(cè)序檢測(cè)作為二線(xiàn)檢測(cè)方法（B,）。臨床疑似血流感染中的適用范圍p 對(duì)于血流感染患者首選DNA測(cè)序：由于大部分血流感染的病原體包括細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)（如瘧原蟲(chóng)）、部分病毒（如皰疹病毒）均以DNA作為遺傳物質(zhì)，所以推薦將DNA二代測(cè)序作為血流感染的首選檢測(cè)方法，僅在不能排除RNA病毒感染（如腎綜合征出血熱、登革熱、病毒性肺炎等）時(shí)推薦進(jìn)行RNA二代測(cè)序。p 檢測(cè)最佳時(shí)間窗起病后目前，由于缺乏抗感染治療對(duì)二代測(cè)序診斷性能影響的高等級(jí)研究，所以在

9、血流感染中二代測(cè)序檢測(cè)的最佳時(shí)間窗仍未確定。研究提示，二代測(cè)序在患者起病后1-2周的時(shí)間內(nèi)仍可保持高于培養(yǎng)的陽(yáng)性率，但其仍可隨時(shí)間推移下降。在臨床疑似局灶性感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)8：常規(guī)檢測(cè)陰性對(duì)于懷疑局灶感染的患者，在對(duì)局灶部位完成常規(guī)的生物化學(xué)、培養(yǎng)或PCR檢測(cè)后，若未能獲取病原學(xué)診斷結(jié)果，推薦將二代測(cè)序作為二線(xiàn)的首選檢測(cè)手段（B,）p 二代測(cè)序可提高皮膚軟組織感染、骨關(guān)節(jié)感染、眼內(nèi)感染、尿路感染、漿膜腔感染、其他組織感染中的病原學(xué)檢測(cè)能力p 二代測(cè)序在局灶性感染標(biāo)本中的較高靈敏性，可能與局灶性感染標(biāo)本中的致病病原體相對(duì)載量較高有關(guān)。p 組織感染:對(duì)創(chuàng)傷弧菌、非結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌

10、等均有較強(qiáng)的診斷價(jià)值p 眼部感染:除了對(duì)常見(jiàn)的病毒、細(xì)菌、真菌性眼內(nèi)炎有診斷價(jià)值以外，還對(duì)不常見(jiàn)的病原體如弓形蟲(chóng)、棘阿米巴、風(fēng)疹病毒、隱球菌等感染有較強(qiáng)的提示作用p 尿路感染：研究顯示其可用于耐藥細(xì)菌的檢測(cè)在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍推薦意見(jiàn)8：常規(guī)檢測(cè)陰性對(duì)于呼吸道感染患者，若3d內(nèi)未通過(guò)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)（A,）推薦意見(jiàn)8：病毒性肺炎常規(guī)檢測(cè)陰性對(duì)于強(qiáng)烈懷疑病毒性肺炎且病情持續(xù)進(jìn)展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR檢測(cè)，若為陰性，再行二代測(cè)序檢測(cè)，并應(yīng)同時(shí)進(jìn)行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄（A,）。p 呼吸道定植菌群和引起感

11、染的病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)：根據(jù)mNGS原理，可對(duì)包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。可在24-72h內(nèi)鑒定標(biāo)本中可能存在的常規(guī)方法無(wú)法鑒定的罕見(jiàn)病原體、病毒等。并可對(duì)多重感染進(jìn)行鑒p 作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的補(bǔ)充：目前，商業(yè)化的mNGS檢測(cè)產(chǎn)品數(shù)據(jù)量大多在20M左右，靈敏度低于熒光PCR等傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法，尚不能替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法（除非提高數(shù)據(jù)量使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法），而是應(yīng)作為傳統(tǒng)方法無(wú)法明確感染病原體時(shí)的補(bǔ)充。在臨床疑似呼吸道感染中的適用范圍p 呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)：根據(jù)mNGS原理，可對(duì)包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)?？稍?4-72

12、h內(nèi)鑒定標(biāo)本中可能存在的常規(guī)方法無(wú)法鑒定的罕見(jiàn)病原體、病毒等。并可對(duì)多重感染進(jìn)行鑒定p 作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法的補(bǔ)充：目前，商業(yè)化的mNGS檢測(cè)產(chǎn)品數(shù)據(jù)量大多在20M左右，靈敏度低于熒光PCR等傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法，尚不能替代傳統(tǒng)檢測(cè)方法（除非加大測(cè)序覆蓋度使其靈敏度大于傳統(tǒng)分子檢測(cè)方法），而是應(yīng)作為傳統(tǒng)方法無(wú)法明確感染病原體時(shí)的補(bǔ)充。普通呼吸道感染：傳統(tǒng)方法mNGS。高度懷疑病毒性肺炎的患者：病毒多重 檢測(cè)以及培養(yǎng)mNGS(注意RNA反轉(zhuǎn)錄檢測(cè))對(duì)于免疫抑制患者出現(xiàn)呼吸道感染或病情危重：傳統(tǒng)方法+mNGS，呼吸道標(biāo)本盡量靠近病灶二代測(cè)序檢測(cè)，以盡早明確罕見(jiàn)病原體或混合感第二節(jié)mNGS流程與質(zhì)量控制一、

13、樣本采集推薦意見(jiàn)11：采集樣本送檢二代測(cè)序必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則（A,）。推薦意見(jiàn)12：樣本應(yīng)直接從患者感染部位的體液或組織中進(jìn)行采集（A,）。推薦意見(jiàn)13：當(dāng)患者存在感染表現(xiàn)但病情危重或不能耐受有創(chuàng)操作時(shí)，可考慮采集患者的血液標(biāo)本送檢（B,）。一、樣本采集原則針對(duì)患者感染部位的不同，采集的樣本類(lèi)型主要包括靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹水、組織、咽拭子、局灶穿刺物等多種類(lèi)型 對(duì)于無(wú)菌體液，如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹水等，需按照嚴(yán)格的無(wú)菌操作采集樣本，采集前對(duì)局部或周?chē)つw進(jìn)行消毒處理，消毒液需與皮膚作用一定時(shí)間，待皮膚干燥后再取樣，一般收集第 管標(biāo)本送檢。采集的樣本須置于無(wú)菌

14、容器內(nèi)。 對(duì)于有菌部位的樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，應(yīng)標(biāo)明樣本的采集部位，在樣本采集過(guò)程中應(yīng)盡量避免引入該部位的正常菌群，以免干擾后續(xù)檢測(cè)結(jié)果。樣本采集原則所有采集的感染部位樣本均應(yīng)及時(shí)送檢。標(biāo)本遠(yuǎn)距離運(yùn)輸需采用冷鏈運(yùn)輸，并保證無(wú)菌原則，避免凍融環(huán)節(jié)二、樣本前處理核酸抽提及文庫(kù)建p 滅活：不同樣本類(lèi)型均來(lái)源于疑似感染部位，具有潛在的感染性，在樣本處理前需進(jìn)行滅活處理。p 去除人員細(xì)胞：為提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏性，在不影響樣本中病原體含量的前提下，可通過(guò)差異離心法或過(guò)濾等選擇性地去除部分人源細(xì)胞（或人源基因組轉(zhuǎn)錄組成分）。p 核酸提?。汉怂岬馁|(zhì)量是決定二代測(cè)序成功的關(guān)鍵，因此不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立

15、完整的核酸檢測(cè)流程，通過(guò)測(cè)定核酸的完整性或降解程度，制訂合格樣本的標(biāo)準(zhǔn)p 文庫(kù)制備：文庫(kù)制備流程對(duì)核酸樣本有嚴(yán)格要求，需對(duì)每次提取的核酸樣本進(jìn)行定量檢測(cè)，以確保核酸量滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。針對(duì)不同樣本類(lèi)型對(duì)提取的核酸進(jìn)行文庫(kù)制備，文庫(kù)制備流程一般包括核酸片段化、末端修復(fù)、標(biāo)簽接頭連接和PCR文庫(kù)等。工程菌和環(huán)境污染微生物：全過(guò)程無(wú)菌操作：設(shè)置內(nèi)參：每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品三、質(zhì)量控制及生物信息分析推薦意見(jiàn)14：實(shí)驗(yàn)室在充分保障生物安全性的前提下，應(yīng)建立完整的核酸檢測(cè)流程（樣本采集，樣本前處理/核酸抽提及文庫(kù)建立，質(zhì)量控制及生物信息分析，二代測(cè)序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀）（A, ）

16、。推薦意見(jiàn)15：每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品。每批次實(shí)驗(yàn)均需嚴(yán)格評(píng)估是否存在操作或環(huán)境帶來(lái)的污染。單個(gè)樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)建議不低于2107條（即20M特異性序列），此外建議測(cè)序序列讀長(zhǎng)不少于單端50bp（A,）。三、質(zhì)量控制及生物信息分析質(zhì)量控制體系：應(yīng)包含多個(gè)質(zhì)量控制點(diǎn)，依次為樣本運(yùn)輸溫控、提取濃度與純度、出庫(kù)濃度、文庫(kù)片段分布、下機(jī)總數(shù)據(jù)量、測(cè)序質(zhì)量（Q20、Q30比率）等，分別監(jiān)控運(yùn)輸溫度、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、下機(jī)數(shù)據(jù)可靠性等方面。全流程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包含但不限于如下幾項(xiàng)：1）內(nèi)參：每批次實(shí)驗(yàn)中都應(yīng)包括內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品 2）數(shù)據(jù)量：在缺乏

17、有效的人源宿主去除步驟的情況下，建議單個(gè)標(biāo)本測(cè)序數(shù)據(jù)量特異性序列片段數(shù)不低于2*107 條（即20M 特異性序列數(shù)）3）讀長(zhǎng)50bp：為確保序列比對(duì)的準(zhǔn)確性，避免因同源錯(cuò)配導(dǎo)致的序列比對(duì)錯(cuò)誤，建議測(cè)序序列單端讀長(zhǎng)不少于50bp三、質(zhì)量控制及生物信息分析推薦意見(jiàn)16：對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，建議采用臨床應(yīng)用級(jí)別的數(shù)據(jù)庫(kù)，審慎使用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（A,）。推薦意見(jiàn)17：建議二代測(cè)序檢測(cè)病原體的報(bào)告應(yīng)涵蓋該批次實(shí)驗(yàn)中的內(nèi)參照、陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品結(jié)果，并記錄相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量、序列讀長(zhǎng)，以及相關(guān)的質(zhì)控參數(shù)（A,）生物信息分析流程應(yīng)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以自動(dòng)化為主，以人工糾錯(cuò)為輔，不應(yīng)帶有過(guò)多的人工判讀

18、成分。三、二代測(cè)序結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室判讀推薦 在進(jìn)入分析解讀流程后應(yīng)遵循以下原則：p 剔除試劑、環(huán)境、測(cè)序和生物信息分析流程中引入的假陽(yáng)性病原體信息，將樣本中含有的病原體核酸信息真實(shí)地呈現(xiàn)給臨床。p 原則上報(bào)告病原體信息應(yīng)準(zhǔn)確到種（檢出序列數(shù)極少或極高相似度的病原體復(fù)合群除外），同時(shí)應(yīng)包含相應(yīng)的屬信息。p 建議根據(jù)病原體出現(xiàn)的頻度和臨床致病性等信息，將臨床高度關(guān)注、健康人樣本中極少出現(xiàn)的病原體核酸信息單獨(dú)呈現(xiàn)（即高度致病可能性），同時(shí)將某些部位（如呼吸道、皮膚、腸道等）的常見(jiàn)、低（或無(wú)）致病性病原體（定植菌等）單獨(dú)呈現(xiàn)。p 建議對(duì)報(bào)告中呈現(xiàn)的所有病原體引用權(quán)威文獻(xiàn)進(jìn)行關(guān)鍵信息的注釋?zhuān)员闩R床能快速做

19、出判斷。報(bào)告中應(yīng)有適度的微生物相關(guān)信息及相關(guān)文獻(xiàn)幫助臨床醫(yī)師理解報(bào)告結(jié)果第三節(jié)mNGS結(jié)果的臨床應(yīng)用建議及其臨床判讀、驗(yàn)證二代測(cè)序結(jié)果的臨床應(yīng)用建議及其臨床判讀、驗(yàn)證推薦意見(jiàn)18：二代測(cè)序結(jié)果應(yīng)在與患者臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查密切結(jié)合的前提下進(jìn)行解讀和驗(yàn)證（B,）。推薦意見(jiàn)19：對(duì)于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根據(jù)推薦意見(jiàn)1至13采集合適的樣本進(jìn)行二代測(cè)序，根據(jù)送檢樣本類(lèi)型結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)及其他結(jié)果輔助判斷或排除診斷，同時(shí)應(yīng)注意排除檢出病原體定植的情況（B,）。推薦意見(jiàn)20：對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果（如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感

20、染的患者，建議必要時(shí)再次取樣重復(fù)二代測(cè)序檢測(cè)（B,）。里程碑論文影響因子 70.67發(fā)表時(shí)間 2014.062014年，一名患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的14歲男童在4個(gè)月的時(shí)間里三次到醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診，發(fā)燒和頭痛發(fā)展為腦積水和癲癇持續(xù)狀態(tài)，導(dǎo)致昏迷。通過(guò)多種抗菌藥物仍然無(wú)法改善腦積水和癲癇狀態(tài)，腦活檢在內(nèi)的診斷無(wú)法找到病因。研究者通過(guò)腦脊液（CSF）宏基因組測(cè)序檢出圣地羅西鉤端螺旋體序列，隨后通過(guò)更換使用青霉素進(jìn)行治療，男童32天后痊愈出院。NGS檢測(cè)病原體：鉤端螺旋體，占比0.016%；驗(yàn)證：靶向PCR和Sanger測(cè)序治療調(diào)整：改用青霉素G治療，32天出院 若二代測(cè)序結(jié)果符合患者的臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)

21、室檢查，推薦根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果指導(dǎo)臨床決策。 若患者二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性且符合臨床表現(xiàn)，但缺乏除二代測(cè)序結(jié)果外的其他實(shí)驗(yàn)室支持證據(jù)，應(yīng)進(jìn)行PCR驗(yàn)證（在具有合適引物的條件下），并建議臨床進(jìn)一步完善可獲得的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查加以驗(yàn)證。 若患者二代測(cè)序結(jié)果陽(yáng)性，但臨床表現(xiàn)或?qū)嶒?yàn)室檢查結(jié)果不支持該結(jié)果，則不能僅根據(jù)二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行診斷，而應(yīng)以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果為首要臨床參考依據(jù)。 對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果為陰性，但根據(jù)其他輔助檢查結(jié)果（如培養(yǎng)結(jié)果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建議必要時(shí)再次取樣重復(fù)二代測(cè)序檢測(cè)。二代測(cè)序結(jié)果的臨床應(yīng)用建議及其臨床判讀、驗(yàn)證第四節(jié)mNGS在臨床感染性疾病中針對(duì)不同病原體類(lèi)型的

22、診斷效能中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染推薦意見(jiàn)21：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中，目前證據(jù)提示二代測(cè)序檢測(cè)細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、病毒的效果較好，中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染仍需更大樣本量的臨床 試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)其檢測(cè)效能（B,）。在 項(xiàng)關(guān)于腦脊液的二代測(cè)序研究中，診斷率分別為0(0/36)、1.6%(2/125)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10) 在無(wú)細(xì)胞的腦脊液上清液中只能檢測(cè)到無(wú)細(xì)胞病毒或無(wú)細(xì)胞微生物核酸，會(huì)導(dǎo)致較低的檢出率，提示臨床應(yīng)采用腦脊液而非上清液作為二代測(cè)序標(biāo)本國(guó)外一項(xiàng)研究顯示，與傳統(tǒng)臨床實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較，二代測(cè)序的靈敏度為73%，特異度為99%， 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為81%，陰性預(yù)測(cè)值為99%另一項(xiàng)前瞻

23、性研究對(duì)腦膜炎、腦炎和（或）脊髓炎患兒中收集到的20份腦脊液陽(yáng)性樣本進(jìn)行二代測(cè)序檢測(cè)，與傳統(tǒng)的腦脊液微生物檢測(cè)相比，二代測(cè)序檢測(cè)診斷致病病原體的靈敏度為92%，特異度為96%。我國(guó)患兒的腦脊液測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，55.56%的二代測(cè)序檢測(cè)結(jié)果與臨床傳統(tǒng)方法學(xué)一致，其中主要的病原體為細(xì)菌。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的初治患者中，與培養(yǎng)相比，二代測(cè)序具有90%的靈敏度，其檢出率較培養(yǎng)提高了約25%。 膿毒癥患者推薦意見(jiàn)22：對(duì)于膿毒癥患者，推薦聯(lián)合采用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和二代測(cè)序來(lái)提高病原學(xué)的檢出率（B,）。血流感染的異質(zhì)性較大，目前尚缺乏針對(duì)血流感染者的大型二代測(cè)序診斷效能研究?，F(xiàn)有的研究結(jié)果提

24、示，血液樣本二代測(cè)序與血培養(yǎng)保持了高度的一致性，是可靠的病原學(xué)檢測(cè)方法。一項(xiàng)中國(guó)的研究顯示，以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，二代測(cè)序的靈敏度和特異度分別為72.7%和89.6% ；二代測(cè)序還表現(xiàn)出了比血培養(yǎng)更高的額外檢測(cè)效能，成為血培養(yǎng)的有力補(bǔ)充若以培養(yǎng)聯(lián)合二代測(cè)序、桑格法測(cè)序驗(yàn)證作為金標(biāo)準(zhǔn)，則二代測(cè)序的陽(yáng)性率較單用血培養(yǎng)有顯著提升（23.08%比12.82% ）另一項(xiàng)關(guān)于膿毒癥休克的研究中，二代測(cè)序的陽(yáng)性率在起病前 周內(nèi)波動(dòng)于71%左右，而血培養(yǎng)陽(yáng)性率僅在起病時(shí)達(dá)33%，此后波動(dòng)于10% 20%局灶膿腫或組織感染患者推薦意見(jiàn)23：對(duì)于局灶膿腫或組織感染患者，二代測(cè)序的總體靈敏性和特異性均較好，其中對(duì)細(xì)菌檢測(cè)的靈敏性?xún)?yōu)于真菌（A,）已有研究證實(shí)，二代測(cè)序在包括局灶膿液、感染部位組織、感染性的體液標(biāo)本中的靈敏性均優(yōu)于傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。在骨關(guān)節(jié)感染中，二代測(cè)序與臨床培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本的一致率可達(dá)83%-84.8%，在培養(yǎng)陰性的標(biāo)本中可額外檢出49.3%-93%的病原體肺組織二代測(cè)序?qū)?xì)菌感染的靈敏度可達(dá)100%，特異度為76.5% ；對(duì)真菌感染的靈敏度為57.1%，特異度為61.5%；對(duì)細(xì)菌和真菌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為42.9%