細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示

1、細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶的顯示 Experiment 6【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?. 掌握細(xì)胞中酸性磷酸酶的顯示方法掌握細(xì)胞中酸性磷酸酶的顯示方法2. 觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的存在部位觀察酸性磷酸酶在細(xì)胞中的存在部位【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹考?xì)胞中存在著能分解磷酸酯的酶，它們可分為一磷酸酯酶、二磷酸酯酶和三磷酸酯酶等三類，其中最主要的是一磷酸酯酶。這類酶按最適pH值又可分為兩類，一類在pH9.5左右的條件下發(fā)揮作用，稱為堿性磷酸酶；另一類在pH5.0左右的條件下發(fā)揮作用，稱為酸性磷酸酶。當(dāng)酸性磷酸酶與含有磷酸酶的作用底物（如甘油磷酸鈉）一起保溫時(shí)，能水解磷酸酯使其釋放出磷酸基，磷酸基進(jìn)而與

2、底物中存在的鉛鹽結(jié)合形成無(wú)色的磷酸鉛（PbHPO4）沉淀物，當(dāng)用黃色的硫化銨作用該沉淀時(shí)可形成黃棕色或棕黑色的硫化鉛沉淀；從而使細(xì)胞中酸性磷酸酶顯示出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為材料顯示該酶的存在?！緦?shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料】一、一、 材料：小白鼠材料：小白鼠二、二、 器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、注射器、蓋玻片、器材：顯微鏡、恒溫水浴鍋、注射器、蓋玻片、載玻片、剪刀、鑷子、酒精燈載玻片、剪刀、鑷子、酒精燈三、三、 試劑：試劑：6%淀粉肉湯、淀粉肉湯、0.85%生理鹽水、酸性磷酸生理鹽水、酸性磷酸酶工作液、福爾馬林、鈣固定液、酶工作液、福爾馬林、鈣固定液、2%硫化銨溶液、硫化銨溶液、甘油明膠封固劑甘

3、油明膠封固劑6%淀粉肉湯淀粉肉湯：稱取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、氯化鈉0.5g加入到100ml蒸餾水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，溫浴溶解，煮沸15分鐘滅菌，置4C冰箱中保存，使用時(shí)水浴融化。0.85%生理鹽水生理鹽水：稱取8.5gNaCl溶于1000ml蒸餾水中。酸性磷酸酶工作液：酸性磷酸酶工作液： 0.05mol/L醋酸緩沖液醋酸緩沖液：先用2ml注射器抽取1.2ml冰乙酸加入到98.8ml蒸餾水中均勻混制成0.2mol/L的醋酸液（A液），再稱取醋酸鈉（NaAc3H2O）2.72g溶于100ml蒸餾水中配成0.2mol/L的醋酸鈉溶液（B液）。取A液30ml加B液70ml混勻即成0.0

4、5mol/L醋酸緩沖液，置4C保存。 3%-甘油磷酸鈉溶液甘油磷酸鈉溶液：稱取-甘油磷酸鈉3g溶于100ml蒸餾水中，4C保存。 工作液工作液：臨用時(shí)，稱取硝酸鉛25mg,溶于22.5ml的0.05mol/L醋酸緩沖溶液中，待全部溶解后，再緩慢地滴加入3%的-甘油磷酸鈉液2.5ml，同時(shí)快速攪動(dòng)，防止產(chǎn)生絮狀物。福爾馬林福爾馬林鈣固定液鈣固定液：先稱取無(wú)水CaCl2 10g溶于100ml蒸餾水中配成10%氯化鈣溶液，取該液10ml加入到80ml蒸餾水混勻，即成福爾馬林鈣固定液。2%硫化銨硫化銨：量取2ml硫化銨加入到98ml蒸餾水中，現(xiàn)配現(xiàn)用。甘油明膠封固劑甘油明膠封固劑：稱取明膠7g加入42

5、ml蒸餾水中，水浴加溫溶解，再加入50ml甘油并攪勻，另加少許麝香草酚作防腐劑，置4C貯存，使用水浴加溫融化?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、取、取20g左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射左右小白鼠一只，每日往其腹腔注射6%淀粉肉湯淀粉肉湯1ml，連續(xù)，連續(xù)三天。三天。2、在第三次注射后、在第三次注射后34小時(shí)，再向腹腔注射生理鹽水小時(shí)，再向腹腔注射生理鹽水1ml。3、過(guò)、過(guò)35分鐘后取腹腔液分鐘后取腹腔液0.10.3ml（注意抽取部位要盡量與注射部位（注意抽取部位要盡量與注射部位相一致，否則難以抽出）或用頸椎脫臼法處死小白鼠后，打開腹腔，相一致，否則難以抽出）或用頸椎脫臼法處死小白鼠后，打開腹腔，用注

6、射器（不裝針頭）直接吸取腹腔液。用注射器（不裝針頭）直接吸取腹腔液。4、往預(yù)冷的蓋玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙簽涂后放入小培養(yǎng)皿、往預(yù)冷的蓋玻片上滴一滴腹腔液，立即用牙簽涂后放入小培養(yǎng)皿4 C冰箱中冰箱中30分鐘，使細(xì)胞自行鋪展開。分鐘，使細(xì)胞自行鋪展開。5、冷風(fēng)吹干玻片，如室溫低于、冷風(fēng)吹干玻片，如室溫低于20 C，可任其自然干燥。，可任其自然干燥。6、往蓋玻片上滴加酸性磷酸酶工作液兩滴（或?qū)⒉Ｆ迦胧⒂兴嵝粤?、往蓋玻片上滴加酸性磷酸酶工作液兩滴（或?qū)⒉Ｆ迦胧⒂兴嵝粤姿峁ぷ饕旱男∪旧字校?，酸工作液的小染色缸中）?7 C溫育溫育30分鐘。分鐘。7、取出蓋玻片用蒸餾水沖洗，然后立于吸水紙上

7、吸去多余水分。、取出蓋玻片用蒸餾水沖洗，然后立于吸水紙上吸去多余水分。8、放入盛有、放入盛有10%福爾馬林福爾馬林鈣固定液的小染色缸內(nèi)處理鈣固定液的小染色缸內(nèi)處理5分鐘，分鐘，進(jìn)行后固定。進(jìn)行后固定。9、取出玻片，在蒸餾水中漂洗，再吸去多余水分。、取出玻片，在蒸餾水中漂洗，再吸去多余水分。10、放入、放入2%硫化銨溶液中處理硫化銨溶液中處理35分鐘。分鐘。11、蒸餾水漂洗。、蒸餾水漂洗。12、取一載玻片，往其中滴一滴明膠甘油封固劑，將帶水的蓋玻、取一載玻片，往其中滴一滴明膠甘油封固劑，將帶水的蓋玻片有細(xì)胞的一面朝下，慢慢蓋向載玻片上的明膠甘油，使蓋玻片片有細(xì)胞的一面朝下，慢慢蓋向載玻片上的明膠甘油，使蓋玻片封固在載玻片上（注意避免氣泡的產(chǎn)生）。封固在載玻片上（注意避免氣泡的產(chǎn)生）。13、觀察：將制備好的標(biāo)本置于光鏡下，在高倍鏡下可見許多呈、觀察：將制備好的標(biāo)本置于光鏡下，在高倍鏡下可見許多呈陽(yáng)性反應(yīng)的巨噬細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多大小不等的棕色或棕陽(yáng)性反應(yīng)的巨噬細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多大小不等的棕色或棕黑色顆粒和斑塊，這便是酸性磷酸酶存在的部位（溶酶體），有黑色顆粒和斑塊，這便是酸性磷酸酶存在的部位（溶酶體），有些細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶極為豐富，故整個(gè)細(xì)胞