HIV感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、常用常用HIV病原學(xué)檢測(cè)方法病原學(xué)檢測(cè)方法: 病毒分離病毒分離 抗原檢測(cè)抗原檢測(cè) 核酸檢測(cè)（核酸檢測(cè)（ cDNA測(cè)定-PCR、 RNA測(cè)定-病毒載量） 其他方法：其他方法：逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定、原位雜交常用常用HIV抗體檢測(cè)方法抗體檢測(cè)方法: ELISA 快速快速HIV檢測(cè)檢測(cè) 免疫印記法免疫印記法 （ Western Blot） 其他方法：其他方法：免疫熒光法（IFA）、放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn) 嬰幼兒HIV抗體陽(yáng)性不能用于診斷感染HIV 嬰幼兒體內(nèi)從母親得到的HIV抗體持續(xù)存在時(shí)間最長(zhǎng)不超過(guò)18個(gè)月。 在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依賴(lài)性的檢驗(yàn)方法對(duì)新生兒HIV感染進(jìn)行輔助診斷，包括：HIV P24

2、抗原檢測(cè)、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測(cè)定。 18月齡以前嬰幼兒感染HIV診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室綜合診斷。 輸血輸血和移植安全（為了接受者的安全）和移植安全（為了接受者的安全） 監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)(為了知曉為了知曉人群流行狀況人群流行狀況) 臨床臨床HIV疾病的疾病的診斷診斷 (為了知曉為了知曉個(gè)體感染狀況個(gè)體感染狀況） 為了達(dá)到以上的某個(gè)目的的為了達(dá)到以上的某個(gè)目的的HIV 檢測(cè)可能不適檢測(cè)可能不適合其他目的，比如輸血服務(wù)的檢測(cè)不適合臨床診合其他目的，比如輸血服務(wù)的檢測(cè)不適合臨床診斷斷HIV感染感染 HIV抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù) 檢）和確認(rèn)試驗(yàn)（WB)。 （一）檢測(cè)試劑 篩查試劑必須是

3、經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、批檢合格、臨床評(píng)估質(zhì)量?jī)?yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其它快速診斷試劑。采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液篩查應(yīng)采用HIV-1/2混合型酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)。 1. 常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）目前國(guó)內(nèi)外主要使用第三代（雙抗原夾心法）試劑，少數(shù)使用第二代試劑。血源篩查仍以第三代ELISA為主，國(guó)際上有些國(guó)家和地區(qū)已將線(xiàn)性免疫酶測(cè)定（第四代ELISA試劑）用于血源篩查。第四代ELISA試劑是最近發(fā)展起來(lái)的HIV抗原抗體聯(lián)合測(cè)定試劑，可同時(shí)檢測(cè)P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試

4、劑相比，檢出時(shí)間提前了4-9.1d。其優(yōu)點(diǎn)在于能同時(shí)檢測(cè)抗原抗體，降低血源篩查的殘余危險(xiǎn)度。 ELISA的原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性 。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。 用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的

5、量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原 間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體 競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲包被法等競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲包被法等 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。 加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗體與固相加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。去其他未結(jié)合物質(zhì)。 加酶標(biāo)抗原，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的加

6、酶標(biāo)抗原，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體與酶標(biāo)抗原結(jié)合，徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗原?？乖?加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗體的量。物。通過(guò)比色，測(cè)知標(biāo)本中抗體的量。包被了包被了HIV 抗原的檢測(cè)抗原的檢測(cè)板板患者的抗體患者的抗體酶酶顯色劑顯色劑+ ve- ve酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)HIV 檢測(cè)的介紹檢測(cè)的介紹ELISAELISA 板板質(zhì)控質(zhì)控陽(yáng)性陽(yáng)性陰性? 結(jié)果結(jié)果Introduction to HIV TestingModule 1 Sub Module 3 PPT0

7、2 隨著對(duì)HIV感染者和AIDS病人抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的進(jìn)展，及對(duì)無(wú)癥狀HIV感染者提供自愿咨詢(xún)檢測(cè)（VCT）的迫切需求，簡(jiǎn)便、快速的HIV檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用。常用的主要有以下幾種： （1）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）：PA是HIV血清抗體檢測(cè)的一種簡(jiǎn)便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時(shí)，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑（AFD HIV-1/2 PA），已經(jīng)我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）注冊(cè)批準(zhǔn)；HIV-1、H

8、IV-2抗原分別致敏的PA試劑（SERODIA-HIV-1/2）可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國(guó)尚未引進(jìn)。 以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點(diǎn)狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽(yáng)性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間在10 min以?xún)?nèi)，使用抗原量少。 金標(biāo)紙條采用雙抗原夾心法免疫測(cè)定原理，選擇經(jīng)純化的基因工程制備的gp36、gp41、p24抗原作為包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作為膠體金結(jié)合抗原。當(dāng)待檢標(biāo)本中含有HIV抗體時(shí)，先和金標(biāo)記抗原結(jié)合，由于層析作用反應(yīng)復(fù)合物沿硝酸纖維膜向前移動(dòng)，當(dāng)遇到包被抗原時(shí)，形成Ag-A

9、b-Ag-Au復(fù)合物而富集在包被線(xiàn)上，形成紅色沉淀線(xiàn)。同時(shí)在包被膜上還有一條質(zhì)控線(xiàn)對(duì)照，故當(dāng)有兩條紅線(xiàn)時(shí)判為陽(yáng)性，只有一條紅線(xiàn)時(shí)，判為陰性。 試劑穩(wěn)定，可室溫長(zhǎng)期保存。試驗(yàn)時(shí)不需任何設(shè)備，迅速、簡(jiǎn)便、特異性較好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門(mén)診急診個(gè)體檢測(cè)。目前已有在國(guó)內(nèi)被SFDA批準(zhǔn)注冊(cè)的國(guó)外進(jìn)口試劑和國(guó)內(nèi)產(chǎn)品。一般可在1030min內(nèi)判讀結(jié)果。無(wú)反應(yīng)無(wú)反應(yīng)反應(yīng)反應(yīng)無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義無(wú)意義金標(biāo)法（膠體硒法）結(jié)果判定 （4）艾滋病唾液檢測(cè)卡：在硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時(shí)檢測(cè)含在唾液中的HIV-1/HIV-2

10、抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測(cè)唾液中的HIV IgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時(shí)間長(zhǎng)且售價(jià)較高。以唾液為樣品測(cè)定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn) 。 （5）其它快速篩查試驗(yàn)方法： 家庭HIV檢測(cè)（Home Access System）等。 快速*平均45分鐘（10分鐘2.5小時(shí)） 常規(guī)平均3.5小時(shí)（94分鐘16小時(shí)）* 一般不要特殊設(shè)備，試劑可不用冰箱存放 一般不用于血液篩查（除5年行動(dòng)計(jì)劃） 有一定的假陽(yáng)性反應(yīng)，如作為臨床診斷，要復(fù)檢和確認(rèn) 有一定的假陰性反應(yīng)（尤其暴露時(shí)間3個(gè)月） 隨訪(fǎng)檢測(cè)（解釋檢測(cè)前后咨詢(xún)

11、必要性） 根據(jù)檢測(cè)目的選用符合要求的篩查試劑對(duì)樣品進(jìn)行初篩和重復(fù)檢測(cè)（復(fù)檢） 初篩試驗(yàn)：以第三代ELISA（雙抗原夾心法）梅里埃試劑為例。 （1）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：試驗(yàn)開(kāi)始前將試劑和樣品放置在室溫(1823), 按實(shí)驗(yàn)室SOP做好試劑準(zhǔn)備。 磷酸鹽緩沖液：若液體內(nèi)有結(jié)晶,應(yīng)放置在37直至溶解，用蒸餾水1：25稀釋濃縮液，4保存2周。 TMB底物液：使用前配制，TMB液和過(guò)氧化脲液等量混勻。 1M硫酸終止液：85 ml蒸餾水中加入5 ml濃硫酸。 備好試劑盒、待檢樣品和外部對(duì)照質(zhì)控血清后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)以及質(zhì)控和安全防護(hù)要求進(jìn)行篩查檢測(cè)。 （2）實(shí)驗(yàn)操作 裝好所需使用數(shù)目的孔條,每孔均加入100l樣品稀

12、釋液。設(shè)3個(gè)陰性對(duì)照孔，1個(gè)HIV-1陽(yáng)性對(duì)照孔，若需要可再設(shè)1個(gè)HIV-2陽(yáng)性對(duì)照孔。 每孔加入50l待檢樣品及對(duì)照（對(duì)照要后加），未用孔用樣品稀釋液加滿(mǎn)以溶解結(jié)合物球，以免堵塞洗板機(jī)孔。可震搖15S，372孵育605min。 置洗板機(jī)上洗滌6遍（用洗液將反應(yīng)孔完全加滿(mǎn),靜置3060S,共洗滌6遍，洗完后孔上方及底部不應(yīng)殘存液體.）。 每孔加入100l底物液，勿攪動(dòng)，室溫避光孵育302min。 每孔加入100l 1M硫酸終止反應(yīng)，充分混勻。 在2h內(nèi)置于酶標(biāo)儀讀數(shù)，單波長(zhǎng)450nm，或雙波長(zhǎng)450/630nm測(cè)OD值。 （3）實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陰性對(duì)照（NC），HIV-1陽(yáng)性對(duì)照（PC1），HIV-2陽(yáng)性對(duì)照（PC2） NC 必須0.25方可用，排除NC0.25的值，計(jì)算NC平均值。 NC界限范圍：0.6倍NC均值NC1.4倍NC均值。 符合以下條件的實(shí)驗(yàn)成立： 兩個(gè)以上的NC可用。 PC1-NC均值 0.4，PC2-NC均值 0.4 Cut off值 = 陰性對(duì)照均值 + 0.100 小于Cut off為陰性，大于或等于Cut off為陽(yáng)性（4）報(bào)告：對(duì)呈陰性