【課件】3.2.2基因工程的基本操作程序課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、選擇性必修3第2節(jié)：基因工程的基本操作程序-2l 擴(kuò)展1：PCR相關(guān)計(jì)算l 擴(kuò)展2：PCR應(yīng)用概述l 拓展3：PCR引物設(shè)計(jì)l 基因表達(dá)載體的構(gòu)建拓展1：PCR相關(guān)計(jì)算長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA_個(gè)含有引物A的DNA_個(gè)含有引物B的DNA_個(gè)211第一次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA_個(gè)2長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA_個(gè)含有引物A的DNA_個(gè)含有引物B的DNA_個(gè)233第二次擴(kuò)增第三次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA_個(gè)4長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA_個(gè)含有引物A的DNA_個(gè)含有引物B的DNA_個(gè)277短鏈-短鏈DNA_個(gè)2第四次擴(kuò)增中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA_個(gè)6長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA_個(gè)含有引物A的DNA_個(gè)含有引物B的DNA_個(gè)21515短鏈-

2、短鏈DNA_個(gè)8擴(kuò)增次數(shù)第1次第2次第3次第4次第n次DNA總數(shù)212223242n長(zhǎng)鏈-中長(zhǎng)鏈DNA中長(zhǎng)鏈-短鏈DNA短鏈-短鏈DNA含引物A(或B)的DNAPCR擴(kuò)增DNA規(guī)律一個(gè)DNA，一對(duì)引物（A與B），通過(guò)PCR擴(kuò)增n次：擴(kuò)增產(chǎn)物中，等長(zhǎng)鏈DNA分子數(shù)為：_個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中，不等長(zhǎng)鏈DNA分子數(shù)為：_個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中，含模板鏈DNA分子數(shù)為：_個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物中，含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：_個(gè)復(fù)制過(guò)程中共需引物_個(gè)第n次復(fù)制需要引物_個(gè)2n-2n2n22n-12n1 - 22nPCR擴(kuò)增DNA規(guī)律1.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在

3、PCR反應(yīng)中加入兩種引物(注：引物的作用是與模板鏈形成雙鏈后在DNA聚合酶的作用下就可以繼續(xù)鏈的延伸)，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如下圖甲所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如下圖乙所示，其中第種DNA分子有()A.8個(gè) B.6個(gè) C.4個(gè) D.2個(gè)A圖中引物中為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。從理論上推測(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占比例為_。15/162.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基本因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。拓展2：PCR應(yīng)用概述擴(kuò)增目的基因檢測(cè)目的基因產(chǎn)生突變基因用模板DNA和目的基因相關(guān)引物擴(kuò)增用待測(cè)DNA和目的相關(guān)引物擴(kuò)增有擴(kuò)增產(chǎn)物則含有目

4、的基因無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物則不含目的基因可在引物中或引物的5端引入突變序列產(chǎn)生大量目的基因產(chǎn)生大量突變基因SRYPCR是對(duì)移植前的胚胎進(jìn)行性別鑒定的技術(shù)。以Y染色體上SRY基因（性別決定基因）的一段序列作引物，用被測(cè)胚胎DNA作_進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)SRY基因序列設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度一般為2024個(gè)核苷酸，其不宜過(guò)短的原因主要是_。兩種引物中GC的含量相差不宜過(guò)大，原因主要是_。防止引物隨機(jī)結(jié)合防止引物隨機(jī)結(jié)合C C、G G含量差別大，含量差別大，低溫復(fù)性難統(tǒng)一低溫復(fù)性難統(tǒng)一模板模板拓展3：PCR引物的設(shè)計(jì)PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的好壞，直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異

5、性擴(kuò)增產(chǎn)物。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增高效性。1.引物設(shè)計(jì)需考慮的兩個(gè)因素?cái)U(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物特異性：只擴(kuò)增出目標(biāo)DNA的特性高效性：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的量特異性太強(qiáng)，擴(kuò)增效率就會(huì)下降提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增特異性就會(huì)下降拓展3：PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則引物長(zhǎng)度一般在15-30堿基之間。過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq 酶進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)短特異性差。引物GC含量一般在40%60%之間，GC含量過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。拓展3：PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

6、否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或引物之間配對(duì)結(jié)合，從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。拓展3：PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則退火溫度退火溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，退火溫度低擴(kuò)增效率高。如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差46不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的。拓展3：PCR引物的設(shè)計(jì)2.引物設(shè)計(jì)的原則引物的5端可以修飾，而3端不可修飾引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)

7、，加標(biāo)記熒光，引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列，引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.基因表達(dá)載體的作用使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在且遺傳給下一代使目的基因在受體細(xì)胞中能夠表達(dá)且發(fā)揮作用是核心步驟2.基因表達(dá)載體的組成質(zhì)粒標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)2.基因表達(dá)載體的組成質(zhì)粒標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)結(jié)合的部位，具有驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的作用。位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來(lái)。供目的基因插入載體中2.基因表達(dá)載體的組成質(zhì)粒標(biāo)記基因

8、復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)2.基因表達(dá)載體的組成質(zhì)粒標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)便于重組DNA的篩選能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上基因克隆載體必須具備的條件標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子終止子限制酶切位點(diǎn)基因表達(dá)載體必須具備的條件基因克隆載體 與 基因表達(dá)載體基因表達(dá)載體插入的目的基因中必須含有能轉(zhuǎn)錄出完整的起始密碼子、終止密碼子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列。項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰堿基mRNA上三個(gè)相鄰堿基位置目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶

9、識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號(hào)決定翻譯過(guò)程的結(jié)束3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程限制酶限制酶同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割DNA連接酶目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因限制酶切割位點(diǎn)質(zhì)粒重組DNA分子3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程限制酶限制酶DNA連接酶質(zhì)粒重組DNA分子第1步：用同種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶分別切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段。第2步：用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，形成重組DNA分子。拓展：“單酶切”與“雙酶切”構(gòu)建基因表達(dá)載體用同一種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶分別切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段構(gòu)建基因

10、表達(dá)載體1.單酶切abcda、b、c、d四個(gè)黏性末端相同。限制酶切割DNA連接酶連接啟動(dòng)子方向目的基因轉(zhuǎn)錄方向思考：?jiǎn)蚊盖杏惺裁慈秉c(diǎn)？單酶切有什么缺點(diǎn)？缺點(diǎn)1：在DNA連接酶的作用下，質(zhì)粒被重新環(huán)化abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接單酶切有什么缺點(diǎn)？缺點(diǎn)2： 在DNA連接酶的作用，目的基因被環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接單酶切有什么缺點(diǎn)？缺點(diǎn)3：在DNA連接酶的作用，目的基因與質(zhì)粒反向連接，造成目的基因不能正確表達(dá)。abcd限制酶切割DNA連接酶連接反向連接重組DNAabcd限制酶切割DNA連接酶連接缺點(diǎn)1缺點(diǎn)2缺點(diǎn)3思考：如何確定以上缺點(diǎn)？單酶切的缺

11、點(diǎn)反向連接重組DNA質(zhì)粒重新環(huán)化目的基因被環(huán)化2.雙酶切用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段構(gòu)建基因表達(dá)載體限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd黏性末端a與相同；黏性末端b與d相同。2.雙酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd質(zhì)粒不會(huì)重新環(huán)化目的基因不會(huì)被環(huán)化優(yōu)點(diǎn)1優(yōu)點(diǎn)2優(yōu)點(diǎn)3 目的基因與質(zhì)粒不會(huì)發(fā)生反向連接1.降鈣素是一種多肽類激素，臨床上用于治療骨質(zhì)疏松癥等。人的降鈣素活性很低，半衰期較短。某科學(xué)機(jī)構(gòu)為了研發(fā)一種活性高、半衰期長(zhǎng)的新型降鈣素，從預(yù)期新型降鈣素的功能出發(fā)，推測(cè)相應(yīng)的脫氧核苷酸序列，并人工合成了

12、兩條72個(gè)堿基的DNA單鏈，兩條鏈通過(guò)18個(gè)堿基對(duì)形成部分雙鏈DNA片段，再利用Klenow酶補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA，過(guò)程如下圖：獲得的雙鏈DNA經(jīng)EcoR(識(shí)別序列和切割位點(diǎn)-GAATTC-)和BamH(識(shí)別序列和切割位點(diǎn)-GGATCC-)雙酶切后插入到大腸桿菌質(zhì)粒中。下列有關(guān)分析錯(cuò)誤的是( )A.Klenow酶是一種DNA聚合酶B.合成的雙鏈DNA有72個(gè)堿基對(duì)C.EcoR和BamH雙酶切的目的是保證目的基因和運(yùn)載體的定向連接D.篩選重組質(zhì)粒需要大腸桿菌質(zhì)粒中含有標(biāo)記基因B乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因（

13、LDH）導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。圖1為乳酸和乙醇發(fā)酵途徑示意圖，圖2為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。(1)據(jù)圖2分析，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LDH需要設(shè)計(jì)引物，引物的作用是_，擴(kuò)增n次后，需要的引物1的數(shù)量至少是_。能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸使DNA 聚合酶2n-1乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影響產(chǎn)量。釀酒酵母耐酸能力較強(qiáng)，但不產(chǎn)生乳酸。研究者將乳酸菌的乳酸脫氫酶基因（LDH）導(dǎo)入釀酒酵母，獲得能產(chǎn)生乳酸的工程菌株。圖1為乳酸和乙醇發(fā)酵途徑示意圖，圖2為構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)所需的關(guān)鍵條件。（2）研究發(fā)現(xiàn)，真核生物起始密碼子序列偏好 ATG，為保證擴(kuò)增出的LDH以正確方向插入質(zhì)粒需要利用雙酶切技術(shù)，設(shè)計(jì)引物1的5端序列時(shí)，應(yīng)考慮_。包含BamHI的識(shí)別序列；將 GTG改為ATG乳酸菌是乳酸的傳統(tǒng)生產(chǎn)菌，但耐酸能力較差，影