新生隱球菌的致病機(jī)理

1、1隱球菌病的致病菌1CC.1Mature basidiaPostmeiotic mitosisMeiosisKaryogamyin basidiumDikaryotic hyphaeConjugationHaploid cycleaa aLife CycleMATa X MATa a1Blood streamBrainCryptococcosis: Route of infection and dissemination1隱球菌病隱球菌病病原菌病原菌: :新生隱球菌新生隱球菌感染途徑感染途徑 : : 吸入，皮膚，胃腸道？吸入，皮膚，胃腸道？分布分布 : : 世界范圍世界范圍 腦、肺、皮膚、骨和

2、關(guān)節(jié)腦、肺、皮膚、骨和關(guān)節(jié) HIV, HIV, 淋巴瘤淋巴瘤, , 激素治療激素治療, , 器官移植器官移植 原發(fā)性原發(fā)性CD4 CD4 淋巴細(xì)胞減少淋巴細(xì)胞減少未治療的腦膜炎死亡率為未治療的腦膜炎死亡率為100% 100% 易感因素易感因素 : :易感器官：易感器官：預(yù)后預(yù)后 : :1莢莢 膜膜黑黑 素素磷脂酶磷脂酶37 37 下生長(zhǎng)良好下生長(zhǎng)良好1新生隱球菌是如何穿過(guò)血腦屏障后進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的？新生隱球菌是如何穿過(guò)血腦屏障后進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的？為什么新生隱球菌易于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)？為什么新生隱球菌易于感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)？新生隱球菌進(jìn)入機(jī)體的途徑是否只有吸入肺部后入血一個(gè)？新生隱球菌進(jìn)入機(jī)體

3、的途徑是否只有吸入肺部后入血一個(gè)？1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）建立血腦屏障模型，觀察新生隱球菌對(duì)）建立血腦屏障模型，觀察新生隱球菌對(duì)HUVEC的影響的影響 新生隱球菌靜脈感染新生隱球菌靜脈感染C57BL/6小鼠后，檢測(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)新生隱球菌感染情況，大腦皮小鼠后，檢測(cè)大腦皮質(zhì)內(nèi)新生隱球菌感染情況，大腦皮質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡及大腦皮質(zhì)中特異蛋白的表達(dá)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡及大腦皮質(zhì)中特異蛋白的表達(dá) 1Mouse model of cryptococcosis1 血腦屏障模式圖血腦屏障模式圖1 緊密連接緊密連接血腦屏障血腦屏障病原體病原體1231: 1: 細(xì)胞內(nèi)侵襲細(xì)胞內(nèi)侵襲2: 2: 細(xì)胞旁通

4、過(guò)打開(kāi)緊密連接細(xì)胞旁通過(guò)打開(kāi)緊密連接3: 木馬機(jī)制：通過(guò)巨嗜細(xì)胞穿越木馬機(jī)制：通過(guò)巨嗜細(xì)胞穿越ECM巨嗜細(xì)胞巨嗜細(xì)胞病原體穿越血腦屏障的方式病原體穿越血腦屏障的方式 1HBMEC HBMEC 單層單層半通透膜半通透膜Filter- insertFilter- insert腦側(cè)腦側(cè)血液側(cè)血液側(cè)新生隱球菌新生隱球菌檢測(cè)新生隱球菌通過(guò)血腦屏障的體外模型檢測(cè)新生隱球菌通過(guò)血腦屏障的體外模型1A: A: 對(duì)照組對(duì)照組 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 新生隱球菌侵襲血腦屏障新生隱球菌侵襲血腦屏障ECEC細(xì)胞的凋亡率細(xì)胞的凋亡率 1A: A: 對(duì)照組對(duì)照組 B:

5、0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h B: 0.5h C: 0.5h D: 0.5h E: 0.5h F: 6h G: 6h H: 12h 1 A: A: 對(duì)照組對(duì)照組 B: 2h C: 6h D: 12h B: 2h C: 6h D: 12h 1A A：對(duì)照組：對(duì)照組 B B：2h C2h C：6h6h：DD：12h 12h 1A A：對(duì)照組：對(duì)照組 B B：2h C2h C：6h6h：DD：12h 12h 1HUVEC 緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)緊密連接胞質(zhì)附著蛋白緊密連接胞質(zhì)附著蛋白 ZO-1ZO-1血管滲透因子血管

6、滲透因子VEGFVEGFIL-6IL-61 大腦皮質(zhì)大腦皮質(zhì)PASPAS染色染色 A A：C group BC group B：CTX group CTX group C C：0.5h D0.5h D：2h E2h E：6h F6h F：12h G12h G：24h H24h H：72h72h大腦皮質(zhì)透射電鏡大腦皮質(zhì)透射電鏡 A A：C group BC group B：24h C24h C：72h D72h D：C C group Egroup E：24h F24h F：72h 72h 1 小鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2在不同時(shí)相點(diǎn)的比較 不同時(shí)相點(diǎn)的小鼠大腦皮質(zhì)凋亡細(xì)胞比較 不同時(shí)相點(diǎn)的小鼠大腦皮

7、質(zhì)Bax比較 1 1新生隱球菌入血后到達(dá)血腦屏障，新生隱球菌入血后到達(dá)血腦屏障，通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子如通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子如IL-6IL-6和和VEGFVEGF等作用引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，等作用引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，緊密連接開(kāi)放，細(xì)胞間隙增大，并可能使血腦屏障完整性被破壞，緊密連接開(kāi)放，細(xì)胞間隙增大，并可能使血腦屏障完整性被破壞，穿越血腦屏障，感染宿主腦組織穿越血腦屏障，感染宿主腦組織 1新生隱球菌的跨膜作用新生隱球菌的跨膜作用穿越腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接穿越腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡其它相關(guān)因子導(dǎo)致的通透性的增加其它相關(guān)因子導(dǎo)致的通透性的增加1利用蛋

8、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析新生隱球菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)譜利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析新生隱球菌與血管內(nèi)皮細(xì)胞共孵育后血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)譜的變化的變化篩選差異表達(dá)蛋白，并在基因的轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行驗(yàn)證篩選差異表達(dá)蛋白，并在基因的轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行驗(yàn)證 1實(shí)驗(yàn)組蛋白二維凝膠電泳圖譜實(shí)驗(yàn)組蛋白二維凝膠電泳圖譜 對(duì)照組蛋白二維凝膠電泳圖譜對(duì)照組蛋白二維凝膠電泳圖譜1共找到可信差異表達(dá)蛋白點(diǎn)共找到可信差異表達(dá)蛋白點(diǎn)1919個(gè)個(gè)5 5個(gè)蛋白點(diǎn)僅在對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)個(gè)蛋白點(diǎn)僅在對(duì)照組細(xì)胞中表達(dá)3 3個(gè)蛋白點(diǎn)僅在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)個(gè)蛋白點(diǎn)僅在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)1010個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)降低個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表

9、達(dá)降低1 1個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)升高個(gè)蛋白點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中表達(dá)升高 1S100A10S100A10Prx Prx Prohibitin (PHB)Prohibitin (PHB) HSP27HSP27Malate dehydrogenase Malate dehydrogenase CacyBP CacyBP PSA7_HUMAN PSA7_HUMAN cofilin cofilin 1增強(qiáng)細(xì)胞骨架活動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞胞吞胞吐活動(dòng)增強(qiáng)細(xì)胞骨架活動(dòng)能力，促進(jìn)細(xì)胞胞吞胞吐活動(dòng) 減少減少HUVECHUVEC對(duì)氧應(yīng)激的耐受能力，細(xì)胞損傷增加，增殖能力下降對(duì)氧應(yīng)激的耐受能力，細(xì)胞損傷增加，增殖能力下

10、降 促進(jìn)細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞凋亡 影響了影響了HUVECHUVEC正常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程正常的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 抑制細(xì)胞能量代謝抑制細(xì)胞能量代謝 1小鼠原發(fā)性皮膚隱球菌感染模型的建立小鼠原發(fā)性皮膚隱球菌感染模型的建立宿主免疫狀態(tài)、隱球菌變種和莢膜與皮膚隱球菌感染的關(guān)系宿主免疫狀態(tài)、隱球菌變種和莢膜與皮膚隱球菌感染的關(guān)系小鼠隱球菌皮膚感染后是否發(fā)生播散小鼠隱球菌皮膚感染后是否發(fā)生播散人角質(zhì)形成細(xì)胞株人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCatHaCat體外與新生隱球菌相互作用體外與新生隱球菌相互作用 11傳染性軟疣樣皮損傳染性軟疣樣皮損潰瘍潰瘍結(jié)節(jié)樣皮損結(jié)節(jié)樣皮損PASPAS染色染色 1免疫抑制與免疫正常小鼠各個(gè)

11、臟器及血液真菌培養(yǎng)均為陰性免疫抑制與免疫正常小鼠各個(gè)臟器及血液真菌培養(yǎng)均為陰性免疫抑制小鼠血清乳膠凝集試驗(yàn)陽(yáng)性免疫抑制小鼠血清乳膠凝集試驗(yàn)陽(yáng)性 乳膠凝集試驗(yàn)是目前比較成熟的技術(shù)，在去除試驗(yàn)本身因素影響后，其陽(yáng)性率接近乳膠凝集試驗(yàn)是目前比較成熟的技術(shù)，在去除試驗(yàn)本身因素影響后，其陽(yáng)性率接近100100 免疫嚴(yán)重受損的患者，皮膚局部創(chuàng)傷后大劑量接種隱球菌還是可能引起播散性的隱球菌感染免疫嚴(yán)重受損的患者，皮膚局部創(chuàng)傷后大劑量接種隱球菌還是可能引起播散性的隱球菌感染 1免疫抑制的作用可以使隱球菌感染皮損出現(xiàn)時(shí)間提前，感染加重。免疫抑制的作用可以使隱球菌感染皮損出現(xiàn)時(shí)間提前，感染加重。無(wú)莢膜株與父代有莢

12、膜株在皮膚的致病力方面沒(méi)有明顯差別無(wú)莢膜株與父代有莢膜株在皮膚的致病力方面沒(méi)有明顯差別 兩個(gè)變種之間的致病力沒(méi)有顯著差別兩個(gè)變種之間的致病力沒(méi)有顯著差別1新生隱球菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的時(shí)間粘附率0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124時(shí)間：h粘附率cap64B3501ATCC32609新生隱球菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的時(shí)間通過(guò)率0%5%10%15%20%25%2468時(shí)間：h通過(guò)率cap64B3501ATCC32609新生隱球菌對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響0510152025300.512時(shí)間：h調(diào)亡率：cap64B3501ATCC32609空白對(duì)照killed-B3501不同共同培養(yǎng)方式對(duì)角

13、質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響0510152025300.5h1h2h時(shí)間調(diào)亡率：cap64cap64不接觸B3501B3501不接觸killed-B3501ATCC32609ATCC32609不接觸空白對(duì)照1角質(zhì)形成細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞中的B3501B3501，可見(jiàn)菌體正在出芽?？梢?jiàn)菌體正在出芽。角質(zhì)形成細(xì)胞中的角質(zhì)形成細(xì)胞中的cap64cap64，可見(jiàn)菌體中出現(xiàn)空泡。可見(jiàn)菌體中出現(xiàn)空泡。1空白對(duì)照空白對(duì)照 B3501作用作用2h cap64作用作用2hGenistein預(yù)處理前后粘附率的比較0%5%10%15%20%25%30%35%0.5124時(shí)間：h粘附率cap64cap64-預(yù)處理B3501B3501預(yù)處理ATCC32609預(yù)處理ATCC32609-Genistein預(yù)處理前后隱球菌通過(guò)率的比較0%5%10%15%20%25%2468時(shí)間：h透過(guò)率cap64cap64-預(yù)處理B3501B3