TSK-GEL色譜柱使用中的常見(jiàn)故障及故障排除(中文)100921

1、Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.TSKGEL色譜柱使用中的常見(jiàn)問(wèn)題及故障排除色譜柱使用中的常見(jiàn)問(wèn)題及故障排除東曹（上海）生物科技有限公司Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.2010.10Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜 (SEC/SW)離子交換色譜離子交換色譜 (IEC)疏水反應(yīng)色譜疏水反應(yīng)色譜 (HIC)親和色譜親和色譜 (AFC)反相色譜反相色譜(RPC)正相色譜正相色譜 (NPC/HILIC)保護(hù)柱保護(hù)柱FAQ內(nèi)容概要內(nèi)容概要Tosoh Bioscienc

2、e Shanghai Co., Ltd.HPLCSECHICIECAFCBioAssist 2SWXL, 3SWXL, 4SWXLBioAssist 6PWTSKgel G2000SWXL, G3000SWXL, G4000SWXLBioAssist PhenylTSKgel Phenyl-5PW, Ether-5PWBioAssist ChelateTSKgel Chelate-5PW, Heparin-5PW, TSKgel Blue-5PW, ABA-5PWBioAssist Q, BioAssist STSKgel DEAE-5PW, SuperQ-5PW, TSKgel SP-5PW

3、, CM-5PW TSKgel DEAE-NPR, SP-NPR, DNA-NPRRPCTSKgel Octadecyl-2PW, -4PW, -NPRTSKgel Phenyl-5PW RPTSKgel ODS-100V, ODS-100Z, ODS-100S, ODS-80Ts生物分離色譜柱生物分離色譜柱-TSK-GEL BioAssist 系列及其他系列及其他Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法1樣品吸附太強(qiáng)難以被洗脫樣品吸附太強(qiáng)難以被洗脫1樣品與色譜柱填料上的硅羥基發(fā)生離子性相互作用。樣品與色譜柱填料上的硅羥基發(fā)生離

4、子性相互作用。 (a) 將緩沖液中的離子強(qiáng)度增加至 0.3 (如;含有 0.3 M NaCl的 50 mM 磷酸鈉緩沖液 ,pH 6.8）(b) 將pH值減少到5.5左右 (如;含有 0.1 M Na2SO4的 50 mM 磷酸鈉緩沖液 ,pH 5.5)2分子量大于分子量大于300K的蛋白質(zhì)（或多聚體及二聚體）有可能發(fā)生非特異性吸附（疏水）。的蛋白質(zhì)（或多聚體及二聚體）有可能發(fā)生非特異性吸附（疏水）。(a) 在實(shí)際分析之前先進(jìn)樣數(shù)次（總共上樣約1mg左右，如：質(zhì)粒樣品） 這種現(xiàn)象會(huì)發(fā)生在第一次使用新柱子時(shí)。3疏水分子（如多肽）間發(fā)生疏水相互作用。 (a) 在流動(dòng)相中添加一些有機(jī)溶劑，如：乙腈

5、(低于 50 %) (如;含有 40%乙腈的 50 mM 磷酸鈉緩沖液 ,pH 6.8) 2樣品的洗脫越來(lái)越遲緩樣品的洗脫越來(lái)越遲緩1在劣化的色譜柱填料上發(fā)生了離子相互作用。在劣化的色譜柱填料上發(fā)生了離子相互作用。 (a)將緩沖液中的離子強(qiáng)度增加至 0.5 (0.5 M NaCl), 或降低緩沖液的pH值。 完全恢復(fù)色譜柱的功能是不可能的。 使用pH值小于7的緩沖液。2發(fā)生疏水性吸附的雜質(zhì)造成色譜柱堵塞。發(fā)生疏水性吸附的雜質(zhì)造成色譜柱堵塞。(a) 參照操作手冊(cè)添加有機(jī)溶劑清洗色譜柱(b) 安裝保護(hù)柱并適時(shí)更換注注; PW 系列的色譜柱有時(shí)也會(huì)和系列的色譜柱有時(shí)也會(huì)和SW系列一樣發(fā)生疏水性吸附的

6、問(wèn)題。系列一樣發(fā)生疏水性吸附的問(wèn)題。故障排除：尺寸排阻色譜柱故障排除：尺寸排阻色譜柱 (SW)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.ConditionsColumn: TSKgel G3000SWXL (7.8 mm I.D. x 30 cm)Eluent: A; 0.3 mol/L NaCl in 50 mmol/L sodium phosphate buffer, pH 6.7 B; 0.1 mol/L Na2SO4 in 50 mmol/L sodium phosphate buffer, pH 5.0Flow rate: 1.0 mL/min Tempe

7、rature: 25 C Detection: UV (280nm)* Allows indicate albumin peaksSEC分離中的改進(jìn)的分辨率分離中的改進(jìn)的分辨率-流動(dòng)相的影響流動(dòng)相的影響 (pH)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd. 另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。 峰高取決于平衡時(shí)間 (雜質(zhì)含量) 鬼峰甚至重復(fù)出現(xiàn)在空白梯度的同一洗脫位置。 (a) 使用高純度的溶劑 （ phosphate, Tris, Guanidine/HCl等）流動(dòng)相中的離子性雜質(zhì)聚集并被洗出。流動(dòng)相中的離子性雜質(zhì)聚集并被洗出。1在線性梯度的同一

8、洗脫位置重復(fù)出現(xiàn)鬼峰在線性梯度的同一洗脫位置重復(fù)出現(xiàn)鬼峰5(b) pH 梯度應(yīng)該在由不同pH緩沖范圍的緩沖液組成的混合液中進(jìn)行 (匹配的; DEAE-5PW/amine-buffer, 不匹配的; DEAE-5PW/phosphate or acetate)(a) 按照離子交換填料的官能團(tuán)選擇合適的緩沖液（重現(xiàn)性非常不好）緩沖液中的離子與填料基質(zhì)結(jié)合形成了離子對(duì)。緩沖液中的離子與填料基質(zhì)結(jié)合形成了離子對(duì)。1pH在入口和出口處不同，即很難平衡在入口和出口處不同，即很難平衡4(b)添加不會(huì)干擾結(jié)合的鹽(0.05-0.1 M NaCl)(a) 濃縮樣品縮短上樣時(shí)間 這種情況發(fā)生在使用低鹽緩沖液上樣過(guò)

9、程超過(guò)1個(gè)小時(shí)的時(shí)候長(zhǎng)時(shí)間的上樣過(guò)程中，樣品發(fā)生變性或疏水性吸附長(zhǎng)時(shí)間的上樣過(guò)程中，樣品發(fā)生變性或疏水性吸附1當(dāng)上樣量放大后，回收率變低了當(dāng)上樣量放大后，回收率變低了3(b)使用有機(jī)溶劑清洗(a)使用酸性溶液或堿性溶液進(jìn)行清洗樣品中的疏水性雜質(zhì)吸附在填料上干擾了正常的結(jié)合樣品中的疏水性雜質(zhì)吸附在填料上干擾了正常的結(jié)合1進(jìn)樣若干次后對(duì)樣品的吸附能力逐漸下降進(jìn)樣若干次后對(duì)樣品的吸附能力逐漸下降2(a) 通過(guò)透析來(lái)對(duì)樣品溶液脫鹽處理樣品溶液的樣品溶液的pH值與緩沖液的不同值與緩沖液的不同2 特別是在下一步中將會(huì)使用疏水模式的樣品應(yīng)該按照以上方法處理(a) 通過(guò)透析或用緩沖液（非鹽緩沖液）來(lái)對(duì)樣品溶液

10、脫鹽處理樣品溶液中的離子強(qiáng)度太高樣品溶液中的離子強(qiáng)度太高1樣品吸附不夠充分樣品吸附不夠充分1原因和解決方法原因和解決方法問(wèn)題問(wèn)題故障排除：離子交換色譜故障排除：離子交換色譜 (IEC)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.選擇合適的緩沖體系選擇合適的緩沖體系Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.Column ；TSKgel DEAE-5PW (7.5mmI.D.7.5cm）Eluent； A:20mmol/l Tris-HCl buffer B:20mmol/l Phosphate buffer AA+0.5mol/l NaCl（

11、60minlinear gradient） BB+0.5mol/l NaClFlow rate；1.0mL/minTemperature；Ambient Detection；pH monitorPhosphate buffer(difficult to recover to initial pH)Tris-buffer (easy to recover to initial pH)DEAE-5PW: positive chargesTris : positive chargesPhosphate : negative charges在離子交換填料的洗脫出口處不穩(wěn)定的在離子交換填料的洗脫出口處不

12、穩(wěn)定的pH值值不匹配的離子交換填料與緩沖液不匹配的離子交換填料與緩沖液Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.BioAssist Q 10 x10 Methacrylate typeCommercial Q type 6mL Styrene type-1000100200300400500600700800900051015Retention time (min)mAU 280nm0102030405060708090mS/cm-1000100200300400500600700800900051015Retention time (min)mAU 280nm01

13、02030405060708090mS/cmPurity check of Mab Samples on TSKgel G3000SWXL00.511.522.533.505101520Peak area of IgG 19%Peak area of IgG 65%Peak area of IgG 80%BioAssist Q 10 x10FractionCommercial Q 6mLFractionStock solutionRetention time (min)使用大孔徑的使用大孔徑的IEC色譜柱純化蛋白質(zhì)色譜柱純化蛋白質(zhì)單抗的分辨率大大改進(jìn)單抗的分辨率大大改進(jìn)Tosoh Biosci

14、ence Shanghai Co., Ltd.AIECBindingColumn size( mm I.D. x mm Height)capacity*2 x 754.6 x 355 x 507.8 x 508 x 7510 x 10021.5 x 15022 x 200Column volume (ml)(mg/ml gel)0.20.612485476DEAE-NPR30.6BioAssist Q8428-221DEAE-5PW30210-38540SuperQ-5PW93731-1181,674DEAE-Toyopearl3010243879540760SuperQ-Toyopearl

15、650130431041653422,3403,293QAE-Toyopearl 550C702356891841,2601,773結(jié)合載量是通過(guò)溶菌酶來(lái)計(jì)算的BioAssist S ; 4.6 mmID x 50 mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會(huì)因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格AIEC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽 避免過(guò)載避免過(guò)載Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.CIECBinding Column size ( mm I.D. x mm Height)capacity*2 x 754.6 x 3

16、55 x 507.8 x 508 x 7510 x 10021.5 x 15022 x 200Column volume (ml)(mg/ml gel)0.20.612485476SP-NPR51BioAssist S9030-237SP-5PW54418-68972CM-5PW48416-61864SP-Toyopearl 650501740631329001,267SP-Toyopearl 550C10033801272631,8002,533MegaCap SP-550EC10836861372841,9442,736CM-Toyopearl 650401332511057201,013

17、結(jié)合載量是通過(guò)溶菌酶來(lái)計(jì)算的BioAssist S ; 4.6 mmID x 50 mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會(huì)因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格CIEC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽 避免過(guò)載避免過(guò)載Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法1樣品未被洗脫（吸附太強(qiáng)）樣品未被洗脫（吸附太強(qiáng)）1樣品與填料間的反應(yīng)太過(guò)強(qiáng)烈。樣品與填料間的反應(yīng)太過(guò)強(qiáng)烈。(a) 使用疏水性相對(duì)較弱的柱子 (如： Ether-5PW替代Phenyl-5PW)(b) 添加5 %的有機(jī)溶劑（異丙醇、

18、乙醇等）或2 M 尿素于流動(dòng)相中 2樣品在進(jìn)樣前發(fā)生沉淀。樣品在進(jìn)樣前發(fā)生沉淀。(a) 將硫銨的濃度降低到0.5M來(lái)確認(rèn)樣品的溶解性2樣品較早溶出并且峰形很寬樣品較早溶出并且峰形很寬1樣品溶液中的硫銨濃度太低。樣品溶液中的硫銨濃度太低。(a) 將樣品中的硫銨濃度增加到至少1M (將等體積的樣品溶液與硫銨溶液混合) 3基線不穩(wěn)基線不穩(wěn)1緩沖液試劑中的雜質(zhì)被梯度洗脫。緩沖液試劑中的雜質(zhì)被梯度洗脫。(出現(xiàn)鬼峰出現(xiàn)鬼峰)(a) 使用高純度的試劑 (酶純化級(jí)別的試劑). 鬼峰甚至重復(fù)出現(xiàn)在空白梯度的同一洗脫位置。 峰高取決于平衡時(shí)間 (雜質(zhì)含量) 另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。

19、注注; 第一次嘗試時(shí)推薦首選第一次嘗試時(shí)推薦首選 Phenyl-5PW色譜柱（可在較寬范圍內(nèi)吸附蛋白樣品色譜柱（可在較寬范圍內(nèi)吸附蛋白樣品 ） 有些蛋白因?yàn)樘盍系氖杷蕴醵荒鼙挥行┑鞍滓驗(yàn)樘盍系氖杷蕴醵荒鼙?Ether-5PW吸附。吸附。 對(duì)于對(duì)于HIC，在使用前可以先將流動(dòng)相過(guò)濾，因?yàn)橛袝r(shí)試劑中會(huì)含有一些沉淀物。，在使用前可以先將流動(dòng)相過(guò)濾，因?yàn)橛袝r(shí)試劑中會(huì)含有一些沉淀物。故障排除：疏水反應(yīng)色譜故障排除：疏水反應(yīng)色譜 (HIC)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.Column; TSKgel Phenyl-5PW 7.5 mmI.D. x 7.5

20、cmElution; A 60 min linear gradient of ammonium sulfate from 1.5 M to 0 in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) at a flow rate of 1.0 ml/min, detected by UV absorbance at 280 nmWeak retention peak may be eluted earlier and broaderunless sample contains min. 0.5 M ammonium sulfate.Dissolve sample with buf

21、fer containing min. 0.5 M ammonium sulfate(Dilute sample equally with buffer containig 1.5 M salt)峰形展寬峰形展寬HIC對(duì)樣品的分離效果對(duì)樣品的分離效果Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.HICBinding Column size ( mm I.D. x mm Height)capacity*2 x 754.6 x 355 x 507.8 x 508 x 7510 x 10021.5 x 15022 x 200Column volume (ml)(mg/ml g

22、el)0.20.612485476Butyl-NPR51Ether-5PW201.6725360BioAssist Phenyl-5PW2528203266450Ether-Toyopearl 65031102539558785PPG-Toyopearl 6003512284492630887Phenyl-Toyopearl 65039133149103702988Butyl-Toyopearl 650401332511057201,013SuperButyl-Toyopearl 550C521742661379361,317Hexyl-Toyopearl 650401332511057201

23、,013BioAssist Phenyl ; 4.6 mmID x 50 mm降低上樣量可以提高分離度樣品載量會(huì)因?yàn)殡s質(zhì)含量的不同而有所區(qū)別藍(lán)色標(biāo)注的是商品化的色譜柱規(guī)格HIC模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽模式下樣品上樣量的經(jīng)驗(yàn)值一覽 避免過(guò)載避免過(guò)載Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.色譜柱色譜柱問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法Chelate-5PW1樣品的吸附很弱樣品的吸附很弱1金屬離子鍵合量過(guò)低或鍵合了不匹配的金屬離子。金屬離子鍵合量過(guò)低或鍵合了不匹配的金屬離子。(a) 注入用蒸餾水溶解后的金屬離子。(b) 使用銅離子(Cu2+) 來(lái)代替鋅離子(Zn2

24、+)。2樣品的吸附逐漸變?nèi)鯓悠返奈街饾u變?nèi)?分離時(shí)金屬離子脫落。分離時(shí)金屬離子脫落。(a) 對(duì)于鋅離子，每次上樣后都要使用EDTA來(lái)清洗和再生。(b) 對(duì)于銅離子，每上5次樣后都要使用EDTA來(lái)清洗和再生。2流動(dòng)相緩沖液與填料上的金屬離子發(fā)生螯合。流動(dòng)相緩沖液與填料上的金屬離子發(fā)生螯合。(a) 避免使用氨衍生緩沖液如Tris、檸檬酸鹽緩沖液。3樣品吸附太強(qiáng)樣品吸附太強(qiáng)1金屬離子與樣品間的相互作用太強(qiáng)。金屬離子與樣品間的相互作用太強(qiáng)。(a) 使用螯合能力相對(duì)較弱的金屬離子，如：鋅或鎳(b) 具有很強(qiáng)吸附能力的樣品可以使用 20 mM EDTA + 0.5 M NaCl來(lái)稀釋。2樣品發(fā)生了離子交

25、換作用而不是螯合作用。樣品發(fā)生了離子交換作用而不是螯合作用。(a) 向流動(dòng)相緩沖液中加鹽(0.5 M NaCl)。Boronate-5PW1樣品的吸附很弱樣品的吸附很弱1推測(cè)可能是二硫鍵不夠穩(wěn)定。推測(cè)可能是二硫鍵不夠穩(wěn)定。(a) 向吸附緩沖液中添加10 mM的MgCl2。Tresyl-5PW目標(biāo)分子的吸附載量與通過(guò)固定配體含目標(biāo)分子的吸附載量與通過(guò)固定配體含量來(lái)預(yù)測(cè)的數(shù)字相比，顯得特別低量來(lái)預(yù)測(cè)的數(shù)字相比，顯得特別低1配體蛋白變性，不能按照正常的配體蛋白變性，不能按照正常的AFC多位點(diǎn)吸附來(lái)進(jìn)行。多位點(diǎn)吸附來(lái)進(jìn)行。(a) 縮短配對(duì)時(shí)間。(b) 使用高濃度的配體溶液來(lái)配對(duì)。故障排除：親和色譜故障

26、排除：親和色譜 (AFC)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法1基線不穩(wěn)定基線不穩(wěn)定1由水中或試劑中的有機(jī)雜質(zhì)所引起。由水中或試劑中的有機(jī)雜質(zhì)所引起。(a) 使用超純蒸餾水或HPLC級(jí)別的蒸餾水。(b) 在使用前先將流動(dòng)相在ODS柱上流過(guò)過(guò)濾。2脫氣不充分脫氣不充分 (與設(shè)備相關(guān)與設(shè)備相關(guān))(a) 在使用前脫氣或使用脫氣溶劑。 TFA 在脫氣后加入。（出現(xiàn)鬼峰）（出現(xiàn)鬼峰）3流動(dòng)相中的流動(dòng)相中的TFA發(fā)生降解。發(fā)生降解。(a) 在分析前現(xiàn)配TFA溶液。2即使使用空白梯度，在線性梯度的同一洗脫位置即使使用空白梯度，在線性梯度的

27、同一洗脫位置1流動(dòng)相中的疏水性雜質(zhì)富集并被洗脫。流動(dòng)相中的疏水性雜質(zhì)富集并被洗脫。重復(fù)出現(xiàn)鬼峰重復(fù)出現(xiàn)鬼峰(a) 使用高純度的試劑，（如磷酸、硫酸鹽、TFA等） 鬼峰面積隨著平衡時(shí)間的增加，雜質(zhì)富集而增加。 另一方面，不穩(wěn)定的（非重復(fù)的）鬼峰與儀器的不穩(wěn)定有關(guān)系。3樣品在高碳含量的樣品在高碳含量的ODS柱中保留不好柱中保留不好1固定相在低有機(jī)溶劑濃度固定相在低有機(jī)溶劑濃度(50%)的環(huán)境中作用并不是很充分。（流動(dòng)相含水量高的環(huán)境中作用并不是很充分。（流動(dòng)相含水量高)(a) 使用單層鍵合含碳量較低的(15%) 的ODS柱，如： ODS-80Ts。(b) 使用正相色譜來(lái)代替。4離子性樣品洗脫的重現(xiàn)

28、性不好離子性樣品洗脫的重現(xiàn)性不好1流動(dòng)相的流動(dòng)相的pH值與離子性樣品的值與離子性樣品的pKa值很接近。值很接近。(a) 使用與樣品pKa值相差1.5以上的流動(dòng)相pH值。5樣品的保留不好樣品的保留不好1樣品用有機(jī)溶劑溶解后加速了洗脫。樣品用有機(jī)溶劑溶解后加速了洗脫。(樣品洗脫呈樣品洗脫呈2個(gè)峰但峰形很寬）個(gè)峰但峰形很寬） (a) 至少使用與洗脫液開(kāi)始濃度的有機(jī)溶劑、或與其濃度相仿的有機(jī)溶劑來(lái)溶解樣品。 故障排除：反相色譜故障排除：反相色譜 (RPC)-(1)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法6多肽樣品保留不好多肽樣品保留不好

29、1填料的疏水性太弱。填料的疏水性太弱。(a) 使用硅膠基質(zhì)的ODS柱代替樹(shù)脂基質(zhì)的反相柱。(b) 添加離子對(duì)試劑，如： TFA (0.2 %)(出峰太快）出峰太快）2流動(dòng)相的重新平衡不充分流動(dòng)相的重新平衡不充分(a) 使用不含有機(jī)溶劑的流動(dòng)相來(lái)平衡至少需要1個(gè)小時(shí)來(lái)得到重復(fù)性好的譜圖。即使使用分析柱時(shí)也一樣。7蛋白質(zhì)樣品的吸附很弱蛋白質(zhì)樣品的吸附很弱1樣品溶液中的蛋白質(zhì)變性不充分。樣品溶液中的蛋白質(zhì)變性不充分。(a) 用最初的流動(dòng)相 (如： 0.05 % TFA) 來(lái)溶解或稀釋蛋白樣品并促成蛋白變性。 (b) 增加離子對(duì)試劑的濃度，如：大于 0.05 %的TFA8蛋白或多肽樣品不能充分洗脫（吸

30、附太強(qiáng)）蛋白或多肽樣品不能充分洗脫（吸附太強(qiáng)）1填料與樣品的作用太強(qiáng)了。填料與樣品的作用太強(qiáng)了。(a) 降低離子對(duì)試劑的濃度，如：低于 0.02 %的TFA(b) 提高流動(dòng)相的 pH值。 (根據(jù) pH 的變化，選擇性也會(huì)發(fā)生變化) 對(duì)于ODS柱， 用 50 mM 的磷酸緩沖液將pH提高到7.0 對(duì)于樹(shù)脂基質(zhì)的柱子，用50 mM的Na2HPO4將pH提高到9.5(蛋白或多肽的回收率很低蛋白或多肽的回收率很低)2色譜柱填料的孔徑太小了色譜柱填料的孔徑太小了 (或疏水性太強(qiáng)或疏水性太強(qiáng))(a) 使用更大孔徑的柱子，如： TSKgel Phenyl-5PW RP故障排除：反相色譜故障排除：反相色譜 (

31、RPC)-(2)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.051015Retention time (min)Column: TSKgel ODS-100V (4.6mmI.D. x 15cm)Eluent: A; 10mM NaH2PO4/CH3CN=85/15 B; 10mM NaH2PO4/CH3CN=30/70Gradient: 0min(B ; 0%)15min(B ; 75%)Flow rate: 1.0mL/minDetector: UV (265nm)Injection vol.: 20LConcentration: 10g/LColumn temp

32、.: 401: sulfisomidine 2: sulfamerazine3: sulfamethoxazole4: sulfaquinoxaline methanol 100%methanol 70%methanol 30%methanol 10%1234樣品溶液中的有機(jī)溶劑濃度應(yīng)當(dāng)不高于初始流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的濃度樣品溶液中的有機(jī)溶劑濃度應(yīng)當(dāng)不高于初始流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的濃度Slight peak broadeningSerious peak broadeningBad peak shape峰形展寬峰形展寬 (1)RPC下樣品溶液中不同濃度有機(jī)溶劑的影響比較下樣品溶液中不同濃度有機(jī)溶劑的影響

33、比較Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.Column; TSKgel ODS-80Ts (2 mmI.D. x 15 cm)Elution; A 30 min linear gradient of acetonitrile from 0 to 70 % in 0.1 % TFA at a flow rate of 0.2 ml/min, detected by UV absorbance at 215 nm.除非經(jīng)過(guò)充分并且正確的平除非經(jīng)過(guò)充分并且正確的平衡衡(10-20 個(gè)柱體積的平衡個(gè)柱體積的平衡)，否則這些峰的洗脫是沒(méi)有重否則這些峰的洗脫是沒(méi)有重復(fù)性的。

34、復(fù)性的。 Gradient elution; Initial; 0% Final; 70 % acetonitrile峰形展寬峰形展寬 (2)RPC下重現(xiàn)性良好的多肽消化物的分離下重現(xiàn)性良好的多肽消化物的分離Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.Column; TSKgel Phenyl-5PW RP 4.6 mmI.D. x 7.5 cmElution: A 44 min linear gradient of acetonitrile from 5% to 60 % in 0.02 % TFA at a flow rate of 1.0 ml/min, det

35、ected by UV absorbance at 220 nmCaster Bean Lectin (RCA)對(duì)于保留很強(qiáng)的蛋白質(zhì)：對(duì)于保留很強(qiáng)的蛋白質(zhì)： 大孔徑的填料大孔徑的填料: 100 nm 低離子對(duì)試劑濃度低離子對(duì)試劑濃度: 0.02 % (流動(dòng)相的流動(dòng)相的pH: 酸性到中性酸性到中性)RPC保留太強(qiáng)、回收率很低保留太強(qiáng)、回收率很低大孔徑填料和離子對(duì)試劑的影響大孔徑填料和離子對(duì)試劑的影響Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題原因和解決辦法原因和解決辦法1樣品的吸附不充分樣品的吸附不充分1有機(jī)溶劑濃度太低（流速太快）。有機(jī)溶劑濃度太低（流速太快）

36、。(a) 用含有高濃度有機(jī)溶劑的溶液來(lái)溶解樣品。 但是，要注意防止樣品在溶液中發(fā)生沉淀。(b) 減少樣品的進(jìn)樣量。2進(jìn)樣量太大。進(jìn)樣量太大。(a) 進(jìn)樣量小于50微升（小于 200微克)。2在在Amide-80柱上，同一樣品洗脫出柱上，同一樣品洗脫出2個(gè)峰個(gè)峰1在在Amide型色譜柱上分離出了樣品的異構(gòu)體型色譜柱上分離出了樣品的異構(gòu)體 (Amide-80)。(a) 在 80下進(jìn)行分析以消除異構(gòu)體的影響。(b) 添加100 mM的三乙胺 。(不需要升高分析溫度)(c) 使用NH2 型色譜柱。3使用使用NH2型色譜柱時(shí)，還原性多糖的回收率型色譜柱時(shí)，還原性多糖的回收率很低很低1樣品與填料基質(zhì)上的樣

37、品與填料基質(zhì)上的Shiffs堿發(fā)生作用。堿發(fā)生作用。(a) 使用Amide型色譜柱(Amide-80)。故障排除：正相色譜故障排除：正相色譜 (NPC, HILIC)Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.更換保護(hù)柱更換保護(hù)柱1使用保護(hù)柱或保護(hù)膠來(lái)保護(hù)分析柱。2發(fā)生問(wèn)題時(shí)， 檢查一下是否可以通過(guò)更換保護(hù)柱來(lái)解決問(wèn)題。3用高純度（過(guò)濾后的）標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)驗(yàn)證柱效，檢查有無(wú)保護(hù)柱時(shí)譜圖是否發(fā)生變化。4如果問(wèn)題的發(fā)生僅是因?yàn)楸Ｗo(hù)柱，那么更換保護(hù)柱后，柱效問(wèn)題就能得到修復(fù)。更換保護(hù)柱外的故障排除更換保護(hù)柱外的故障排除癥狀原因故障排除正常峰形，不溶物堵住了柱子入口處。更換或清洗接

38、口但柱壓升高很多峰形變寬，柱壓升高柱頭處的填料柱床發(fā)生塌陷。柱子已經(jīng)劣化了，更換柱子柱壓正常，但峰形發(fā)生變化柱頭處由于發(fā)生吸附作用填料被污染根據(jù)操作說(shuō)明清洗柱子（有時(shí)是接口處吸附并累計(jì)不溶物所造成的）峰開(kāi)叉柱中填料間出現(xiàn)縫隙（形成多流路）柱子已經(jīng)劣化了，更換柱子保護(hù)柱保護(hù)柱Tosoh Bioscience Shanghai Co., Ltd.問(wèn)題問(wèn)題回答回答我在使用 TSKgel G3000SWXL色譜柱時(shí)，發(fā)現(xiàn)柱頭處的柱床有空隙.。 我該怎樣修復(fù)？參考操作說(shuō)明使用 Top-off gel來(lái)充填?？障恫淮髸r(shí)可以通過(guò)這個(gè)方法來(lái)解決。使用 TSK-GEL SW(XL）色譜柱來(lái)分離水溶性蛋白質(zhì)時(shí) 的

39、典型流動(dòng)相是什么？ 含有0.3 M NaCl 的50mM的磷酸緩沖液 (pH 6.8)。使用TSKgel G3000SWXL來(lái)分離膜蛋白時(shí)，可以使用 什么條件？ 通常，可以使用含有0.2mol/L NaCl的50 mmol/L 的磷酸緩沖液 （pH7.0）， 20% 丙三醇 和去垢劑 （e.g. 0.2%Triton X-100)。 圖譜會(huì)因?yàn)槭褂萌ス竸┑姆N類(lèi)和濃度不同而發(fā)生變化。 參考我們的Separation Report No. 50。我在使用 TSKgel G3000SWXL 時(shí)，流動(dòng)相中加入了去垢劑。我是否需要換成不含去垢劑的流動(dòng)相？ 只有在專(zhuān)用色譜柱時(shí)才推薦流動(dòng)相中有去垢劑。去垢劑

40、很難被徹底除去， 即使清洗色譜柱。使用 TSKgel G3000SWXL 時(shí)能否使用含有g(shù)uanidine-HCl 或尿素之類(lèi)變性劑的流動(dòng)相？可以使用含有 6 M guanidine-HCl或 8 M urea 的流動(dòng)相。但是，在使用前需要先過(guò)濾除去流動(dòng)相中的不溶物，或安裝過(guò)濾頭。 由于變性劑會(huì)使流動(dòng)相的粘度升高，從而使柱壓升高，因此分離分析時(shí)的流速需要控制地低一些。此色譜柱需要用作使用變性劑的專(zhuān)用柱。TSKgel G-Oligo-PW一般用于分離什么樣品?中性低聚糖或者非離子型的合成低聚物。對(duì)于離子型低聚物和水溶性聚合物，可以使用 TSKgel G6000PWXL, G5000PWXL, G4000PWXL,