Y染色體微缺失檢測指導

1、Y染色體微缺失分子檢測在中國已開展多年，國內專家對AZF缺失模式、檢測序列標簽位點（sequence-taggedsite,STS）的數(shù)量、檢測方法和內部質量控制等臨床問題未達成共識。各實驗室的診斷操作方法有很大不同，導致不準確或錯誤診斷時有發(fā)生，迫切需要建立Y染色體微缺失診斷標準和質量控制標準。EAA/EMQ屋新的2013版指南對以上問題都給出了明確的專家共識，對我國建立自己的檢測指南有重要的指導意義。1、 Y染色體微缺失發(fā)生頻率Y染色體微缺失在健康人群中發(fā)生率約為1/4000，但在不育男性中顯著升高，微缺失發(fā)生頻率為2310%（«至更高）。2013版指南指出Y染色體微缺失在中國不

2、育男性中發(fā)生頻率為11.5%，處于較高水平。2006年朱曉斌等1針對中國不育男性染色體的研究表明AZF微缺失在非梗阻性無精子癥患者中的發(fā)生率為9.94%,嚴重少精子癥患者中發(fā)生率為5.82%，與國內外其他學者的研究基本一致。隨著微缺失分子機制的闡明和Y染色體男性特異區(qū)域的結構（MSY）測序完成，結合十多年臨床數(shù)據分析，EAA專家總結沿用Repping等2對Y染色體微缺失區(qū)域的定義模式，分為：AZFa區(qū)缺失、AZFb區(qū)缺失、AZFbc區(qū)缺失和AZFc區(qū)缺失，認為只有該微缺失模式有明確的臨床表現(xiàn)。國內外學者對AZFd區(qū)缺失是否存在一直存有爭議。盡管發(fā)現(xiàn)在AZFb與AZFc兩區(qū)域之間存在新的缺失位點

3、（一些學者認為的AZFd區(qū)缺失），但是該區(qū)域缺失沒有明確的臨床意義，也并非獨立存在的缺失模式。所以第四區(qū)域AZFd區(qū)缺失仍存在較多爭議。Misltmanolu等3在2005年的一項研究中指出AZFd缺失可能與精子形成有關，但仍缺乏有力的臨床證據。2013年，陳科等4在精子正常和輕度少精子癥患者中都發(fā)現(xiàn)了假定的AZFd區(qū)缺失。然而，至今為止AZFd區(qū)域尚未發(fā)現(xiàn)與精子生成相關的候選基因，其缺失所對應的臨床表型還需進一步確認。2、 gr/gr缺失不納入常規(guī)檢查項目研究證實gr/gr缺失屬于AZFc部分缺失，是影響精子生成的一個重要因素，但是否需要將其作為常規(guī)檢查指標尚存爭議。盡管gr/gr缺失可導致

4、AZFc區(qū)一半以上基因丟失，但其臨床意義仍不明確，因為該缺失患者精子生成表型變化多樣，從少精到精子數(shù)目正常都存在。gr/gr缺失表型在不同人種和地域間存在差異，已有研究證實在歐洲白種人（除了法國人5和德國人6）和西太平洋居民中，gr/gr缺失是男性生精障礙的高危因素7。但在部分亞洲國家如日本和中國8,9，gr/gr缺失在健康人群中的概率和在不育患者的概率無顯著差別。李錚等10研究發(fā)現(xiàn)Y染色體gr/gr缺失既存在于嚴重不育男性，也存在于生精功能正常的捐精者中，缺失可能遺傳自父親，并未影響精子的發(fā)生，不能認為是精子發(fā)生的遺傳風險因子。因此在中國gr/gr缺失不建議作為Y染色體微缺失常規(guī)檢測的缺失模

5、式。三、AZF缺失基因型/表型相關性Y染色體微缺失主要是AZF的缺失，該區(qū)域包含精子生成的相關基因家族，不同程度的缺失可導致少精子或無精子癥。AZF區(qū)進一步可分為AZFaAZFb>AZFc區(qū)域。AZFa區(qū)域缺失通常導致唯支持細胞綜合征（SCO綜合征）和無精子癥。如果診斷為整個AZFa區(qū)域缺失，從睪丸中獲得精子的概率為0。AZFb和AZFbc（P5/P1近端；P5/P1遠端，P4/P1遠端）缺失的典型睪丸組織學特征是SCO綜合征或精子發(fā)生阻滯導致的無精子癥。研究表明這些缺失與整個AZFa區(qū)域缺失情況一樣，患者也不能通過睪丸穿刺（TESE）獲得精子。嚴重少精子或無精子癥患者中AZFc缺失發(fā)生

6、頻率最高，AZFc缺失的臨床表型和睪丸組織學類型多種多樣。一般說來，AZFc缺失患者尚殘存精子生成能力。罕見情況下，其缺失在自然狀態(tài)下可遺傳給其男性后代11。近50%AZF儂失的無精子癥患者可通過TESE獲得精子，進行單精子卵胞漿內注射（ICSI）受孕，但這些患者的男性后代都將是AZFc缺失的攜帶者。4、 Y染色體微缺失檢測人群Y染色體微缺失檢測不僅可以明確嚴重少精子或無精子癥的病因，而且可以對預后做出一定的評估。Y染色體微缺失通常見于無精子癥或精子濃度少于2X106/ml的患者。一般的臨床參數(shù)，如激素水平、睪丸大小、精索靜脈曲張、睪丸畸形、感染等對是否存在Y染色體微缺失沒有任何預測價值，Y染

7、色體微缺失必須通過分子檢測來確定。擬行ICSI的嚴重少精子癥應該做Y染色體微缺失檢測，而對非梗阻性無精子癥患者在行TESE<者睪丸顯微切開取精術前也應該進行常規(guī)檢測，因為當整個AZFa整個AZFb>AZFbc或者AZFabc缺失時都不建議給患者做手術。需要特別提醒的是，如果采用輔助生育技術，AZFc缺失可以垂直遺傳給男性后代。如果患者通過AZF檢測發(fā)現(xiàn)部分AZFaAZFb或AZFc缺失，建議家族中其他男性也進行AZF檢測，因為這種缺失是可以遺傳的。但整個AZFaAZFbAZFbc或者AZFabc缺失時不建議家族其他男性成員做AZF檢測，因為這些缺失通常沒有精子生成。對丈夫攜帶AZF

8、c區(qū)缺失類型的夫妻，研究其ICSI受孕情況12,大部分研究表明Y染色體微缺失存在與否不影響受精率和受孕率，但也有個別報道指出微缺失會導致受精率下降，影響胚胎質量，降低囊胚率和ICSI成功率13。5、 STSY染色體微缺失上的STS位點高達131個，如果用于Y染色體微缺失檢測的STS過少，將有可能漏檢某些區(qū)域的缺失，但若采用的STS過多，則可能包含一些多態(tài)性序列，而這些位點在正?？捎行灾幸部沙霈F(xiàn)缺失。指南指出，原則上只要對每個AZF區(qū)域一個非多態(tài)性的STS位點進行分析就足以判斷AZFaAZFb>AZFc是否存在缺失。任何一個已知缺失區(qū)域都包括多個STS位點，每個區(qū)域設置2個STS位點有助

9、于增加檢測的準確性。鑒于眾多實驗室經驗總結和外部質量控制，并考慮到多重PCRT增的形式，在1999和2004版指南中推薦的經典STS引物仍然有效，這些引物包括：AZFa:sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc:sY254、sY255（都在DAZ基因上）。這些STS位點引物由多個實驗室和外部質量控制實驗證明：結果可信重復性好。采用這些引物幾乎能夠檢測到所有臨床上的相關缺失和文獻報道的3個AZF區(qū)域95姒上的缺失，設計的這套引物能完全滿足常規(guī)檢測。它是一個簡單的標準，便于實驗室質量控制和縮小實驗室之間的檢測差異，因此強烈推薦所有實驗室都采用這些引物。指南指出一些檢測方法和試

10、劑可檢測很多STS位點，但并不能提高檢測的靈敏度，反而可能使結果復雜化、難以解釋，因為這可能檢測到很多假的缺失位點，尤其是當DN頌量不好，PCR條件不是最佳時。而大部分試劑盒并沒有額外的單重PCRt確認可疑結果，因此指南并不推薦增加STS位點14o六、PCR的形式和內部質量控制Y染色體微缺失檢測采用多重PC咻系，體系中設置的PCRI物應i包括2個內對照：sY14（SRY）、ZFX/ZFY;6個STS位點：sY84、sY86、sY127、sY134、sY254、sY255。PCR需設立內對照（SRY、ZFX/ZFY基因），陽性對照（健康的男性DNA1陰性對照（女性DNA光口水空白對照（用水代替模

11、板，即含有除模板DN微卜所有成分的PCR反應）。陽性對照監(jiān)測實驗操作是否有效，陰性對照監(jiān)測DNA否污染，空白對照監(jiān)測試劑是否污染。內對照SRY基因是男性性別決定基因，位于Y染色體短臂，內對照SRY基因可以在ZFY基因丟失時證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。ZFX基因檢測不僅可以作為女性DNA寸照，也可作為沒有SRY基因的46,XX男性患者唯一的陽性對照。指南推薦的相關操作都經過認真設計和優(yōu)化，采用兩管多重PCRK應，每管多重PCR反應體系中都包括每個區(qū)域的一個位點。當標本出現(xiàn)整個AZFaAZFb或AZFc區(qū)缺失時，兩管PC皈應中相應區(qū)域設置的2個STS位點產物都會缺失。當AZF

12、a和AZFb區(qū)域出現(xiàn)部分缺失時，相關區(qū)域單個位點的缺失是有可能的，但需小心求證，對整個區(qū)域進行詳細的研究，目前這種情況很少見，被認為是例外。通常認為AZFc區(qū)的sY254或sY255單個缺失是實驗結果錯誤。7、 Y染色體微缺失檢測方法EAA/EMQNt薦采用多重PC昉法中&測Y染色體微缺失?；诙嘀豍CR的Y染色體微缺失檢測方法很多，如實時熒光PCR(Real-timePCR電泳法和芯片法等。Real-timePCR檢測采用熒光標記探針，不涉及電泳，檢測速度更快，數(shù)字化結果更加直觀，因此指南推薦有條件的實驗室都應采用該方法。在沒有Real-timePCR檢測儀的實驗室，可采用電泳法或毛細電泳法。其他的檢測方法如基因芯片檢測，其花費昂貴，且包含太多不必要的位點，不為指南所推薦。實驗室建立一種新的檢測方法，都需經過大量樣本驗證，并明確指出所采用的方法，而不是簡單的描述"根據指南方法"。指南推薦方法特指兩管多重PC昉法，檢測位點如上文所述6個經典位點。8、 EAA/EMQN12年實驗總結進行AZF檢測的實驗室應該加入"EQA計劃”o從2000至2012年