狂犬病的試驗(yàn)室檢測(cè)與診斷技術(shù)

1、狂犬病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)與診斷技術(shù) 1. 臨床診斷與實(shí)驗(yàn)室診斷 實(shí)驗(yàn)室手段對(duì)狂犬病的確診非常必要。 要求狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)上報(bào)資料要注明診斷的依據(jù)（是否包括實(shí)驗(yàn)室診斷？）。目前國(guó)際上公認(rèn)狂犬病的死亡率是100%，原則上不承認(rèn)有狂犬病康復(fù)的可能，即狂犬病的發(fā)病率應(yīng)與死亡率相等。沒有合格實(shí)驗(yàn)室給出的肯定診斷的康復(fù)病例應(yīng)從狂犬病病例的統(tǒng)計(jì)數(shù)字中剔除。 “狂犬病患者必死無疑，不死不算狂犬病” ，要挑戰(zhàn)這個(gè)命題，必須提供確切、完整的病史和權(quán)威的實(shí)驗(yàn)室診斷資料。2. 人狂犬病的生存期內(nèi)診斷 生存期內(nèi)的診斷技術(shù)的選擇主要隨著病程的不同而異。 在病后最初幾天，檢測(cè)抗原一般是敏感的。 腦脊液及血清中的病毒中和抗體常常趨

2、向于在病后710天出現(xiàn)。 檢測(cè)抗原可用熒光抗體（FA）法檢查狂犬病患者角膜印片或皮膚活組織，但是，F(xiàn)A陽性標(biāo)本在發(fā)病的后期更常見。皮膚活組織檢查常常從頸背部取含有末稍神經(jīng)的帶有毛囊的標(biāo)本。 角膜印片(切勿劃痕)取自伴有腦炎的患者，用顯微鏡的載波片輕輕觸及角膜的中心部位。 角膜印片及皮膚活組織標(biāo)本的質(zhì)量很重要，采取后應(yīng)立即冷凍，直至檢測(cè)。不過，用FA技術(shù)做生存期內(nèi)的診斷，其敏感性是有限的。 人狂犬病的生存期內(nèi)診斷 已證實(shí)患者及自然感染和實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的角膜印片中存在狂犬病抗原。但是，角膜印片檢出率較低，陽性結(jié)果可肯定是狂犬病，而陰性結(jié)果并不能排除是狂犬病的可能。 雖然在臨床癥狀開始時(shí)，在皮膚活組織

3、中可能檢出狂犬病抗原，但早期癥狀時(shí)僅有25-50%的患者為陽性，隨著病情的進(jìn)展陽性率也增加。頸背部皮膚活組織檢查只有一些患者呈陽性結(jié)果，特別是在臨床疾病的早期。 用FA檢查皮膚活組織的靈敏度一般高于檢查角膜印片。 3. 動(dòng)物和人狂犬病的死后診斷 抗原檢測(cè) 病毒分離 病毒鑒定等。 為了確保實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的可信性，必需滿足若干條件： 1. 標(biāo)本質(zhì)量要好； 2. 標(biāo)本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的條件要好（符合GLP標(biāo)準(zhǔn)， 獲得一定級(jí)別的資格認(rèn)證）； 3. 獲得結(jié)果的等待時(shí)間要短； 4. 結(jié)果的傳遞要迅速。二狂犬病診斷實(shí)驗(yàn)室的安全措施 1. 危險(xiǎn)性 在一般的實(shí)驗(yàn)室條件，技術(shù)人員暴露于以下傳染的危險(xiǎn)： 野生狂犬病毒(即街毒

4、)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)接收到的動(dòng)物標(biāo)本進(jìn)行尸體解剖時(shí)或?qū)?biāo)本進(jìn)行加工時(shí)(懸液制備，離心)等，這一類操作是非常危險(xiǎn)的，必須在P3以上條件的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)的病毒(即固定毒)，當(dāng)接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或操作感染的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，特別是制備大量的高濃度病毒時(shí)，主要的傳染來源為手指被有感染的玻璃或工具刺傷或割破；新糜爛的皮膚或粘膜與感染物接觸也應(yīng)認(rèn)為是一種傳染的危險(xiǎn)。雖然固定毒的毒力已大為下降，歷史上僅有一例死于固定毒操作的報(bào)道，但仍有一定的危險(xiǎn)性，因此操作固定毒仍須十分小心。生物安全級(jí)別對(duì)工作人員的要求 (Biological Safety Level, BSL ) (Protection, P )BSL-

5、1：實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)程序方面受過特殊訓(xùn)練，由受過微生物學(xué)或相關(guān)科學(xué)一般訓(xùn)練的科學(xué)工作者監(jiān)督實(shí)驗(yàn)。BSL-2：實(shí)驗(yàn)人員均接受過病源處理方面的特殊培訓(xùn)，并由有資格的科學(xué)工作者指導(dǎo)。BSL-3：實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)在處理致病性的和可能使人致死的病源方面受過專業(yè)訓(xùn)練，并由對(duì)該病源工作有經(jīng)驗(yàn)的、有資格的科學(xué)工作者監(jiān)督。BSL-4：實(shí)驗(yàn)室成員應(yīng)在處理特別危險(xiǎn)的傳染源方面受過特殊和全面的訓(xùn)練，應(yīng)了解標(biāo)準(zhǔn)和特殊操作中一級(jí)和二級(jí)遏制的作用、遏制設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)性能。實(shí)驗(yàn)由在有關(guān)病源方面受過訓(xùn)練、并有工作經(jīng)驗(yàn)的、有資格的科學(xué)工作者監(jiān)督。2. 對(duì)安全操作的建議 操作所有潛在狂犬病感染的材料均應(yīng)在 P2或P3生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行

6、。 對(duì)狂犬病實(shí)驗(yàn)室診斷的安全性要求： 一個(gè)封閉的環(huán)境，專作狂犬病感染性工作 通過緩沖更衣間并限制一定的專業(yè)人員進(jìn)入； 穿專用的實(shí)驗(yàn)室隔離無菌衣和鞋； 操作完畢對(duì)操作臺(tái)進(jìn)行消毒(當(dāng)材料偶然地溢出時(shí)應(yīng)立即用3的雷蘇爾溶液或其他相應(yīng)的消毒劑消毒)； 每日應(yīng)至少消毒地板一次； 所有用后剩余的標(biāo)本，尸解工具，實(shí)驗(yàn)室材料在拿出實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)進(jìn)行高壓蒸氣消毒。 在生物安全柜或隔離器內(nèi)打開動(dòng)物顱蓋骨的操作很困難，技術(shù)人員在操作這項(xiàng)工作時(shí)應(yīng)帶面罩，護(hù)目鏡、手套和圍裙。 由于與狂犬病相關(guān)病毒對(duì)人的致病性還不很了解，所有操作可能含有這些病毒的標(biāo)本均應(yīng)在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。 所有實(shí)驗(yàn)室工作人員務(wù)必進(jìn)行狂犬病疫苗的暴露前免疫

7、，這些人員的中和抗體應(yīng)定期檢查，所有意外地暴露于感染時(shí)必需立即報(bào)告負(fù)責(zé)人。三 狂犬病毒抗原的檢測(cè) 1. 標(biāo)本選擇 在選擇、運(yùn)送標(biāo)本前，實(shí)際操作獲得標(biāo)本的人員與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員事先取得聯(lián)系共同選擇實(shí)驗(yàn)方法是很重要的。1) 標(biāo)本取自個(gè)體的生命期 檢查病毒和(或)抗原：樣品應(yīng)放在干燥試管內(nèi)。樣品的獲取可按下述方法進(jìn)行。 (1)用注射器或吸管吸入法采集唾液(不用棉拭)，CSF，皮膚活檢等樣品。 (2)角膜涂片，用顯微鏡載玻片直接接觸角膜操作(不要用棉拭)，標(biāo)記玻片，空氣干燥并用鋁錫紙單片包裹。 。檢測(cè)抗體：血液、CSF或血清采集于干燥試管內(nèi)，并低溫冰凍存放。 2) 標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體 送至實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的

8、方式依動(dòng)物種類不同而不同。 (1) 小的野生動(dòng)物(包括蝙蝠) 送完整的個(gè)體以便對(duì)動(dòng)物品種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。 (2) 家養(yǎng)食肉動(dòng)物(狗、貓)或野生食肉動(dòng)物 (狐貍、貉、浣熊、臭鼬、豺等) 僅送頭部。 (3) 更大的動(dòng)物(家養(yǎng)或野生食草動(dòng)物) 打開頭蓋骨并取腦送至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本取自死亡后的個(gè)體（人） 對(duì)人狂犬病在有可能進(jìn)行全面尸解時(shí)，把整個(gè)腦取出，或選擇一些部位切下(海馬角、腦干、皮質(zhì)、小腦)送至實(shí)驗(yàn)室。 在特殊情況下(困難的野外條件，動(dòng)物流行病學(xué)檢測(cè))以及因宗教或傳統(tǒng)原因?qū)袢∪藷o法尸解時(shí)，可以用塑料管或吸管穿進(jìn)枕骨孔或眼窩后取出一些腦組織)。 2. 標(biāo)本的運(yùn)送 標(biāo)本運(yùn)送必需嚴(yán)格遵循安全要求，包裝務(wù)

9、必要有保證。 1)可靠的診斷要有一個(gè)保存良好的標(biāo)本； 2)運(yùn)送狂犬病標(biāo)本的服務(wù)人員應(yīng)事先進(jìn)行過抗狂犬病免疫并證明已得到完全的保護(hù)。 3) 小動(dòng)物的軀體或較大動(dòng)物切下的頭部標(biāo)本可用10甲醛溶液處理過的材料包裹，然后放入一個(gè)厚塑料袋內(nèi)扎緊。 如僅取腦(大動(dòng)物)則應(yīng)把腦放人一個(gè)堅(jiān)固的塑料或金屬容器內(nèi)并密封，標(biāo)本作好標(biāo)記，外加第二層包裝并放人泡沫塑料盒中。遠(yuǎn)距離運(yùn)送時(shí)可用干冰保冷。 泡沫塑料盒用牢固的粘性帶仔細(xì)封固；把全部有關(guān)標(biāo)本的資料放在信封內(nèi)固定在盒上，再裝進(jìn)一個(gè)紙板箱內(nèi)。箱上應(yīng)清楚地標(biāo)明“小心，有感染性生物材料，狂犬病診斷用生物學(xué)標(biāo)本”字樣。 當(dāng)無冷凍條件且標(biāo)本較小時(shí)，可以將小塊腦組織放進(jìn)裝有8

10、0甘油緩沖液的小瓶?jī)?nèi)，以保存其感染性。 在無需保存標(biāo)本的感染性，準(zhǔn)備用免疫熒光法檢測(cè)抗原時(shí)，則可將腦組織標(biāo)本用10甲醛固定(固定液內(nèi)應(yīng)含有苦味酸)。 3. 標(biāo)本的獲取 1) 動(dòng)物腦組織的獲取 1) 將動(dòng)物頭部放在解剖臺(tái)上用骨固定鉗于上頒骨處牢牢固定住，用鋒利的屠刀從眼部至顱骨底部作一中線切割。 然后將顳肌從顱部切除，顱蓋骨用割刀和錘子等工具割掉。 對(duì)大動(dòng)物可用一外科骨鋸在眼部二側(cè)上方將頭蓋骨橫切，切除腦膜，將髓質(zhì)和腦神經(jīng)切割后，即可將腦取出放在一紙盤或大平皿內(nèi)。動(dòng)物腦組織的獲取 2) 特異性病毒包涵體在腦的一些部位更豐富，特別是海馬回，為了暴露海馬回，從一腦半球背面約半球間溝外側(cè)2cm處往下通

11、過灰質(zhì)和白質(zhì)直到側(cè)腦室作一縱切。海馬角像一半園柱形閃光體從腦室底部凸出，小腦和腦干也富有病毒包涵體。當(dāng)標(biāo)本保存不好時(shí)，通常腦干，髓質(zhì)和視神經(jīng)還能保持完好。 在常規(guī)的操作中，采集海馬角、一小塊腦干和一小塊皮質(zhì)放在平皿內(nèi)，在底部和上面標(biāo)上標(biāo)本的序號(hào)。平皿立即放置于通風(fēng)柜內(nèi)處理或保存在4冷柜內(nèi)。2) 唾液腺的獲取 為取出頜下腺，在復(fù)蓋于下頜骨間的皮膚上作一切割，將皮膚往外側(cè)翻，兩側(cè)的頜下腺位于頜骨后部邊緣表面。在下頜下淋巴結(jié)的后面（這二種不要相混淆）。 4. 標(biāo)本的快速收集技術(shù) 在某些情況下可能難于或不可能尸解以便打開顱骨取腦, 為減少這些困難已經(jīng)設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)便的技術(shù)，即用塑料管插入顱骨采集一小塊腦組織

12、體。 第一種技術(shù)是用吸管通過枕骨孔插入并往前推至一眼睛部位，則吸管中的腦組織內(nèi)含有部分腦干，小腦，海馬回和皮質(zhì)。 第二種技術(shù)為將吸管通過眼窩后壁(用套管穿孔)并推至枕部，腦組織內(nèi)含有部分皮質(zhì)、海馬回、小腦。 1) 材料 取樣試管、塑料或玻璃吸管、套管。 保存或運(yùn)送溶液：80甘油 PBS。2) 方法 (1) 枕部途徑： 把動(dòng)物頸部往前彎曲，切開枕部和第一頸椎間的皮膚和肌肉； 割開寰椎一枕部韌帶，打開關(guān)節(jié)； 將取樣管通過枕孔插入并推向一只眼，拔出吸管，里面含有腦組織柱狀體。 (2) 后眼框途徑： 將眼球推向一邊，用套管在眼窩后壁穿孔； 將取樣管插人推向顱骨后部對(duì)側(cè)拔出，吸管內(nèi)即含有腦組織柱狀體。

13、(3) 腦柱體的收集： 用合適的棉拭子或用橡皮球從管于的清凈端吹氣將腦柱體從管子內(nèi)推在平皿內(nèi)； 如試驗(yàn)診斷需延期進(jìn)行則將腦柱體放進(jìn)裝有甘油溶液的螺旋蓋小瓶中。 5. 熒光抗體實(shí)驗(yàn) Fluorescent Antibody Test (FAT) 該方法的特點(diǎn)是： 耗時(shí)短，整個(gè)FAT操作需30分鐘，若加上涂片、固定，則需2-4小時(shí)。 與小鼠顱內(nèi)接種試驗(yàn)MIT相比，符合率達(dá)99% 。 需熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體?？袢《究乖瓱晒鈽?biāo)記抗狂犬病毒抗體免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒抗原熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒抗原 FATFAT的技術(shù)要求： 由于狂犬病毒多分布在動(dòng)物腦海馬回及腦干處，因此合適的取樣部位對(duì)抗

14、原的檢測(cè)很重要。 腦樣品印片必須用丙酮固定5-10分鐘，因?yàn)楸扇コ?xì)胞膜表面的脂類，以便抗體到達(dá)細(xì)胞內(nèi)與狂犬病毒結(jié)合。 腦樣品必須保存在含50%甘油的生理鹽水中，印片染色前需用生理鹽水洗滌數(shù)次。 熒光標(biāo)記抗體需最大限度降低非特異性反應(yīng)，因此制備特異性、高效價(jià)的抗體是FAT的關(guān)鍵。 熒光抗體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒抗原 操作要求： 印片不能太厚，否則易出現(xiàn)假陽性 一個(gè)切面最多可印4次，否則易出現(xiàn)假陰性 丙酮固定時(shí)間不宜太長(zhǎng) 洗滌不宜過度 判讀結(jié)果應(yīng)快速，以免熒光淬滅用抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結(jié)合物 我室目前采用抗狂犬病毒核蛋白的單克隆抗體制備熒光結(jié)合物，經(jīng)法國(guó)巴斯德研究所多次實(shí)驗(yàn)，分別檢

15、測(cè)了人、犬、貓、狐貍、臭鼬、蝙蝠等動(dòng)物來源的樣品，證實(shí)我們的熒光抗體具有非特異性小、靈敏度高的特點(diǎn)，質(zhì)量上不比法國(guó)的產(chǎn)品差。 我們用該方法檢測(cè)了我國(guó)廣西狗肉市場(chǎng)上出售的食用狗的腦組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在154份外觀健康的犬中，有5份為狂犬病毒抗原陽性，并且通過乳鼠顱內(nèi)接種，我們已分離到這5株狂犬病街毒株。 6. 快速狂犬病酶免疫診斷法 Rapid Rabies Enzyme Immunodetection (RREID抗狂犬病毒單抗狂犬病毒樣品酶標(biāo)抗狂犬病毒抗體6. 快速狂犬病酶免疫診斷法 技術(shù)特點(diǎn)： 本試劑盒操作方便、快速靈敏，適于大量樣本的檢測(cè)。 本試劑盒中酶標(biāo)板包被后需立即使用或保存于-20C備

16、用。 肉眼觀察：陽性對(duì)照顯黃顏色，陰性對(duì)照完全無色。所有顯黃色樣品，無論深淺均認(rèn)為是陽性。這種肉眼觀察已足夠作出診斷，非常經(jīng)濟(jì)，因?yàn)椴恍枰嘿F的酶標(biāo)儀，也最適合于作現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。 酶標(biāo)儀讀數(shù)：仔細(xì)擦凈平板底面，用450nm濾光片讀數(shù)。陽性對(duì)照光密度值（OD）必須大于1.0單位，陰性對(duì)照OD值須低于0.1單位，判定值（CUT OFF）的確定：陰性對(duì)照OD值 0.008。OD值等于或大于CUT OFF的標(biāo)本均視為陽性。 福爾馬林固定的樣品不適宜作RREID。7. 各種抗原檢測(cè)方法的比較： 直接熒光抗體試驗(yàn)（FAT）: 最大優(yōu)點(diǎn)是快速、費(fèi)用低且敏感性和特異性高。 快速狂犬病酶免疫診斷（RREID

17、）試驗(yàn): 也是一種快速的診斷方法，有非常好的敏感性和特異性；與 FAT一樣，即使標(biāo)本的運(yùn)輸條件不太好，也不會(huì)過多影響結(jié)果。RREID也與腦標(biāo)本快速收集方法相適應(yīng)。 細(xì)胞培養(yǎng)感染試驗(yàn)(RTCIT）: 成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)非常敏感和特異。能在24小時(shí)以內(nèi)得出結(jié)果，可替代小鼠分離病毒的方法。但此法只適合在裝備較好、工作人員受過較好訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 四 狂犬病毒的分離和滴度測(cè)定 1.小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法（MIT）： 該方法敏感，適于不具備組織培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室分離狂犬病毒街毒。 耗時(shí)較長(zhǎng)，僅憑動(dòng)物發(fā)病癥狀不足以確定為狂犬病毒，需配合免疫熒光法作特異性鑒定。小鼠顱內(nèi)接種分離狂犬病毒法 4-6只小白

18、鼠(9-11g重) 樣品，0.03ml/只 4天后觀察小鼠發(fā)病情況2.細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)Cell-culture Isolation Techniques (CIT) 該方法敏感，配合免疫熒光法可進(jìn)行特異性快速診斷。 需在具備組織培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。 狂犬病毒抗原的檢測(cè)與診斷30%腦懸液樣品，5000rmp， 30minN2a細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h后固定，加熒光標(biāo)記的抗狂犬病毒核蛋白抗體細(xì)胞無熒光，表明樣品中不含狂犬病毒細(xì)胞有熒光，表明樣品中含有狂犬病毒膠體金免疫層析法檢測(cè)狂犬病毒抗原 試紙有效性標(biāo)志狂犬病毒陽性標(biāo)志膠體金墊樣品插入端3. 組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法 待測(cè)RV樣品經(jīng)系列稀釋后，

19、分別感染96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的BSR細(xì)胞。該細(xì)胞在感染RV后會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成大量包涵體，其主要成分為RV的NP。感染24小時(shí)后，經(jīng)抗RV NP熒光標(biāo)記抗體特異性染色，可在熒光顯微鏡下觀察到熒光灶（FF, Fluorescence Focus）。 通常在低倍顯微鏡(160X)下檢查8個(gè)視野。滴度用 Reed & Muench 方法計(jì)算，用熒光灶單位(FFU/ml) 2) 結(jié)果 我們將同一份CVS毒種分裝保存于一70，在半年時(shí)間內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次，其滴度相當(dāng)穩(wěn)定（對(duì)于病毒稀釋度1：103.5，t=0.445，P0.05；對(duì)于病毒稀釋度1：104.2，t=0.353，P0.05）。 此 C V S 毒 種

20、 在 小 鼠 中 的 毒 力 滴 度 為 5 . 5 LogLD50/ml (Sm=0.4 Log LD50/ml),可用作毒力參考標(biāo)準(zhǔn)品。 根據(jù)未知RV樣品與此參考樣品在組織培養(yǎng)中用熒光灶單位(FFU/ml)表示的滴度的比值，可直接換算出其在小鼠中的LD50滴度。狂犬病毒抗原檢測(cè)方法的比較診斷技術(shù) 免疫熒光 快速酶 小鼠顱內(nèi) 細(xì)胞培養(yǎng) 膠體金 實(shí)驗(yàn) 免疫診斷 接種 分離技術(shù) 免疫層析法所需時(shí)間 2-3h 3-4h 5-10d 20-24h 5-10min特異性 99.99% 99.96% ND 99.99% ND敏感性 99.99% 98.06% ND 98.21% ND 狂犬病毒抗原的檢測(cè)

21、與診斷多種方法對(duì)廣西狗肉市場(chǎng)狂犬病街毒檢測(cè)結(jié)果樣品例數(shù) MIT RREID IFA PCR（狗腦） 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽性數(shù) 102 4* 4 4 4*3份為狂躁型，1份為麻痹型五 滅活疫苗效價(jià)的測(cè)定 1.改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)在體外快速檢測(cè)滅活狂犬病疫苗效力 基本原理： 將定量的RV中和抗體與系列稀釋的滅活狂犬病疫苗在試管中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，疫苗中的有效抗原成分會(huì)與相應(yīng)中和抗體結(jié)合，即消耗掉部分(或全部)中和抗體。 然后將剩余的中和抗體用 RFFIT方法在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行快速測(cè)定。 疫苗中的有效抗原成分含量越高，剩余的中和抗體的含量越低；經(jīng)與已知效力的疫苗標(biāo)準(zhǔn)品所作的對(duì)照進(jìn)行比較，即

22、可推算出待測(cè)疫苗的效價(jià)。改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)在體外快速檢測(cè)滅活狂犬病疫苗效力 實(shí)例： 我們對(duì)6批滅活狂犬病疫苗用ABT方法測(cè)定4次，并與用NIH試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行比較，兩種方法所得結(jié)果的差別均無顯著意義(t1.39, P0.05)，即這兩種方法的結(jié)果基本相符。 ABT 與NIH 效力試驗(yàn)的結(jié)果有很好的相關(guān)性，而且更加快速、經(jīng)濟(jì)，重復(fù)性更好。該方法在大多數(shù)情況下可取代 NIH 效力試驗(yàn)。改良抗體結(jié)合試驗(yàn)(ABT)的應(yīng)用 改良ABT 相對(duì)于 NIH 試驗(yàn)有許多明顯的優(yōu)點(diǎn), 在德國(guó)等國(guó)已作為常規(guī)方法，在狂犬病疫苗的生產(chǎn)和科研中已普遍使用了約二十年，基本取代了NIH 效力試驗(yàn)。 此方法已載入WHO

23、1996年版的狂犬病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)（第四版）。WHO推薦將此方法用于疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。 不過在歐洲藥典2000年版中，此方法僅是推薦用于RV糖蛋白濃度檢測(cè)的方法之一。當(dāng)然RV糖蛋白濃度與疫苗的效力直接相關(guān)。2. 簡(jiǎn)化的NIH小鼠試驗(yàn)法 簡(jiǎn)化的NIH小鼠試驗(yàn)法原則上與傳統(tǒng)的NIH法沒有區(qū)別。 此方法的核心: 將常規(guī)的測(cè)定三個(gè)稀釋度簡(jiǎn)化為一個(gè)稀釋度，而且此稀釋度只用10只小鼠。 此方法的關(guān)鍵: 正確選定稀釋度。此稀釋度應(yīng)為假定該疫苗剛好達(dá)到2.5 IU/劑的最低合格要求時(shí)的50終點(diǎn)稀釋度(即ED50, 又稱50%有效劑量)。 按此稀釋度接種10只小鼠，以有8只小鼠存活（得到保護(hù)）為合格標(biāo)準(zhǔn)。

24、 稀釋度計(jì)算公式 此稀釋度可由以下公式計(jì)算決定： D=Dm + log10 (n) - log10 (N) log10 (v) 其中，D待測(cè)疫苗的最小ED50（用常用對(duì)數(shù)表示）。 Dm參考品疫苗的平均ED50（用常用對(duì)數(shù)表示）。 n 待測(cè)疫苗效力的最低合格要求（IU/ml）。 N 參考品疫苗的效力（IU/ml）。 v= 單劑待測(cè)疫苗的體積(ml) 國(guó)外文獻(xiàn)上通常采用上述公式。 如參照國(guó)內(nèi)規(guī)程上的表述方式（不用對(duì)數(shù)），則上式可改寫為更直觀的形式： D=(Dm n) (N v) 稀釋度計(jì)算舉例： 某參考品疫苗的效力N=2 IU/ml，其ED50平均 值 是 1 6 倍 稀 釋 ， 用 常 用 對(duì)

25、數(shù) 表 示 為 1 . 2 ， 即Dm=1.2；單劑待測(cè)疫苗體積v=2 ml, 對(duì)其效力的最低合格要求是2.5 IU/劑，因此n=2.5IU / 2ml = 1.25 IU/ml。 按公式計(jì)算：D=1.2 + log1 0 (1.25) - log10 (2) log10 (2) =0.7 100.7=5 即ED50 為5倍稀釋。 如 不 用 對(duì) 數(shù) 而 直 接 計(jì) 算 ， 結(jié) 果 也 相 同 ：D=(161.25)(22)= 5。將待測(cè)疫苗按1:5稀釋接種10只小鼠，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如有8只以上的小鼠存活，則表明該待測(cè)疫苗的效力大于1.25 IU/ml x 2ml = 2.5 IU，即肯定該待測(cè)疫苗

26、達(dá)到最低合格要求。五狂犬病毒核酸的檢測(cè) 1直接檢測(cè)法：用已知的互補(bǔ)于選定的基因區(qū)的一小段核酸序列作探針，進(jìn)行直接分子雜交檢測(cè)目的基因是否存在。 2間接檢測(cè)法：在進(jìn)行分子雜交檢測(cè)目的基因是否存在以前，事先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，再作分子雜交檢測(cè)。由于狂犬病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制產(chǎn)生的是RNA，所以擴(kuò)增的第一步必須將病毒的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，成為互補(bǔ)鏈DNA，然后再將該DNA用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。1. 基因擴(kuò)增(PCR)及檢測(cè) PCR技術(shù)于1990年首次用于檢測(cè)狂犬病毒RNA，近幾年來狂犬病毒分子流行病學(xué)研究的進(jìn)展都與該技術(shù)的應(yīng)用有關(guān)。 對(duì)原始樣品中的微量病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄(RT)產(chǎn)生cDNA后，再

27、經(jīng)PCR進(jìn)行放大。 對(duì)放大產(chǎn)物可根據(jù)診斷或分型的不同需要分別用不同方法進(jìn)行分析，如凝膠電泳、斑點(diǎn)雜交、限制性片段長(zhǎng)度分析(RFLP)、直接測(cè)序等。 與傳統(tǒng)的病毒分離或免疫學(xué)檢測(cè)法相比，PCR在敏感性、特異性、特別是在能提供精確的序列資料等方面都要優(yōu)越得多，因此有希望更廣泛地用于狂犬病的常規(guī)檢測(cè)及分子流行病學(xué)研究。 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電流電泳圖譜RV PCR的目標(biāo)基因 在選擇RV基因組中的目標(biāo)基因時(shí)， 為診斷的目的應(yīng)選基因組上的保守區(qū)。 為分型及鑒別變異株應(yīng)選易變區(qū)。 N基因: 高度保守且大量轉(zhuǎn)錄，適用于常規(guī)檢測(cè)，可檢出大樣品中含量很低的多種狂犬病毒。 L基因: 其內(nèi)的若干區(qū)段也極穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)

28、錄量較低，需采用特別敏感的檢測(cè)方法。 G和 L基因間的間隔序列又稱偽基因: 是進(jìn)化上某個(gè)蛋白編碼基因的殘跡。它最易發(fā)生突變，更能代表病毒的自然進(jìn)化，是最好的進(jìn)化“時(shí)鐘”。對(duì)偽基因的比較特別適用于區(qū)分親緣關(guān)系相近的毒株。 G蛋白: 是誘生中和抗體的主要抗原且不如N蛋白穩(wěn)定。N蛋白雖不能誘生中和抗體，但與免疫保護(hù)反應(yīng)也有一定關(guān)系。為了解不同毒株的抗原特性和交叉保護(hù)的分子基礎(chǔ)，常需要對(duì)G基因和N基因進(jìn)行序列比較分析。2. 以基因擴(kuò)增對(duì)狂犬病毒進(jìn)行分型和來源鑒定 以PCR為基礎(chǔ)的一種簡(jiǎn)便實(shí)用的狂犬病毒分型方法是限制性片段長(zhǎng)度多形性分析 (RFLP)。 例如，用3種限制性內(nèi)切酶即能方便地鑒別基因1、4、

29、5和6型：一套引物可使樣品中N基因的PCR產(chǎn)物為長(zhǎng)約15Kb的片段，對(duì)產(chǎn)物分別用3種限制酶消化： 1)只有Pst I選擇性地切割6型(1個(gè)切點(diǎn))； 2)只有4型不被PvuI切割(其余均為1個(gè)切點(diǎn))； 3)DdeI可將1型切成2段，將5型切成多段。 另一套覆蓋G-L的引物可經(jīng)PCR放大在狂犬病毒及相關(guān)病毒中最多變的偽基因，可用于對(duì)關(guān)系極近及極遠(yuǎn)的毒株定型。對(duì)放大產(chǎn)物用5種限制酶可區(qū)分6種主要疫苗株(PV、ERA、SADB9、 HEP、CVS和PM株)，并可與當(dāng)前流行的野毒株作比較。 若用免疫學(xué)方法，需用8種抗N和 6種抗G單抗才能完成同樣的鑒別任務(wù)。 狂犬病的潛伏期到底能有多長(zhǎng)？PCR技術(shù)應(yīng)用于

30、狂犬病毒來源鑒定的一個(gè)精彩例證： 美國(guó)CDC的Smith等對(duì)從美國(guó)3名狂犬病死者分離的毒株的鑒定。死者均為移民，其一移民時(shí)間已達(dá)6年。 由于在美國(guó)感染狂犬病的機(jī)會(huì)極少，而且PCR序列分析的結(jié)果直接證明分離株分別與死者來源國(guó)家的狗中流行的毒株相同，所以該作者以迄今最令人信服的方式證明了狂犬病的潛伏期可長(zhǎng)達(dá)6年以上。3. 狂犬病毒G基因的序列測(cè)定和系統(tǒng)樹進(jìn)化分析 1981年Anilionist等報(bào)道了狂犬病毒G基因序列，隨后幾年里，又對(duì)幾株狂犬病毒部分的或全部的基因進(jìn)行測(cè)定。由此，通過序列分析，對(duì)各毒株之間的相互關(guān)系有了進(jìn)一步了解，明確了狂犬病毒分類的分子基礎(chǔ)。逐漸將狂犬病毒的核酸、氨基酸序列與已

31、知的生物學(xué)和免疫學(xué)的特性聯(lián)系起來?？梢酝茰y(cè)或確定病毒的抗原決定簇，和病毒致病力有關(guān)的分子基礎(chǔ)，以及病毒感染、復(fù)制和變異等的重要功能性氨基酸區(qū)域。這對(duì)研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和復(fù)制有著重要的指導(dǎo)作用，從而更有利于對(duì)狂犬病毒的預(yù)防和和亞洲不同地區(qū)、不同來源的RV街毒株的基因的全序列，確定決定其毒力、免疫原性和致病性的主要功能區(qū)，進(jìn)行了序列的系統(tǒng)進(jìn)化比較分析，探討我國(guó)及周連地區(qū)RV的遺傳變異規(guī)律。我所與法國(guó)巴斯德研究所一項(xiàng)合作研究的實(shí)例： (1)RT-PCR及測(cè)序引物參考文獻(xiàn)和PV株序列，并用Oligo4.0軟件進(jìn)行校驗(yàn)，最后選取的引物為： N（55-73）5ATG-TAA-CAC-C

32、TC-TAC-AAT-GG3 PA(3000-3019)5TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC3 PB(4077-4096)5ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG3 PC(3894-3913)5GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC3 PD(5516-5536)5GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG3 P15CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT3(2) 病毒RNA的提取及RT-PCR 于四日齡乳鼠腦內(nèi)接種狂犬病病毒，注射量為0.02ml/只。待小鼠出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，取腦進(jìn)行熒光抗體檢測(cè)（IFA）。 對(duì)陽性鼠腦，采用TRIz

33、olReagent(GIBCOBRL)提取總RNA。用N與PC為引物，采用AMVReverseTranscriptase(Promega)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 在0.5 ml Ep管中依次加入35.5 l滅菌水、1l dNTP、5 l 10Buffer、3 l MgCl2 、1 l PA(1ul PC)、1 l PB(1ul PD)、1 l cDNA，短暫離心后100水浴1 min，再加入0.5 l DNA聚合酶，50 l液體石蠟，短暫離心后置于PCR儀：經(jīng)94 1min，58 50 s，72 90 s共循環(huán)40次，72保溫10 min后冷卻至4。10000 r/min離心5 min后取下層水

34、相轉(zhuǎn)入1.5 ml Ep管，取5 l用于電泳鑒定，余下的-20保存用于純化。 (3)產(chǎn)物純化采用WizaedPCRPrepsDNAPurificationSystem(Promega)純化PCR產(chǎn)物。 (4)電泳鑒定、cDNA序列測(cè)定取5l未純化產(chǎn)物或1l純化產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳。測(cè)序由大連寶生物有限公司完成。 (5)序列分析 序列的比較排序采用CLUSTER以及GENEDOC軟件處理。 聚類分析(進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建)2) 結(jié)果和討論： 用計(jì)算機(jī)分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）開放讀碼框架（ORF），四株病毒G基因編碼區(qū)均從起始密碼ATG開始，除終止密碼廣西-4株為TAA外均為TGA，從A

35、TG到終止密碼全長(zhǎng)共1575個(gè)核苷酸殘基。(1)與其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比較(2)狂犬病毒G基因不同區(qū)段比較(3)疫苗的評(píng)價(jià)(4)聚類分析(進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建)五、 狂犬病毒抗體的檢測(cè) WHO狂犬病專家委員會(huì)認(rèn)為大于或等于0.5 IU/ml的抗體水平表示能得到有效的保護(hù)。 1992年第八屆WHO狂犬病專家委員會(huì)肯定并推薦將小鼠中和試驗(yàn)(MNT)和RFFIT作為檢測(cè)RV中和抗體的兩項(xiàng)基本方法，這兩種方法應(yīng)作為其它方法的基準(zhǔn)和參考。 MNT是從上世紀(jì)30年代就開始采用的經(jīng)典方法。 自上世紀(jì)70年代初開始，RFFIT逐漸成為國(guó)際上最廣泛接受的對(duì)MNT的替代方法。WHO專家委員會(huì)建議在可

36、能時(shí)盡量用RFFIT代替MNT，因前者更快速、價(jià)廉，且靈敏度與MNT相同。1.小鼠中和試驗(yàn)（Mouseneutralizing test, MNT） 原理： 將一定量預(yù)先滴定好的攻擊病毒，與待滴定的系列稀釋血清孵育。試驗(yàn)中需設(shè)已知滴度的參照血清。然后將病毒/血清混和物經(jīng)腦內(nèi)注射初成年小白鼠，計(jì)算死亡率和保護(hù)50%動(dòng)物的血清稀釋度。 特點(diǎn)： 可定量檢測(cè)狂犬病毒中和抗體效價(jià)。 需專門技術(shù)培訓(xùn)，操作較繁瑣。 需14天出結(jié)果，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于快速診斷。 需較多試驗(yàn)小鼠，成本高。 動(dòng)物間的個(gè)體差會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。小鼠中和試驗(yàn) 三倍系列稀釋待測(cè)血清 預(yù)先滴定過的中和用狂犬病毒（設(shè) 已 知 國(guó) 際 單 位 的

37、標(biāo) 準(zhǔn) 血 清 對(duì) 照 ） C VS 鼠 腦 懸 液 （ 稀 釋 成 3 0 -300LD50） 等量混合 37保溫1小時(shí)后 37中和1小時(shí) 重復(fù)滴定LD50 顱內(nèi)接種10-12克小白鼠 觀察并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算中和指數(shù)及中和抗體含量2. 快速熒光灶抑制試驗(yàn) （RFFIT） Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test 基本實(shí)驗(yàn)過程： 將固定劑量的CVS病毒與系列稀釋的待測(cè)血清(包括已知滴度的參考血清)一起在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中溫育(體外中和反應(yīng))。 病毒的最適劑量在預(yù)實(shí)驗(yàn)中預(yù)先確定，為經(jīng)24小時(shí)溫育后能使80%的細(xì)胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)

38、的最高稀釋度。 中和反應(yīng)結(jié)束后在每孔中加入等量敏感細(xì)胞(BSR)懸液。 再經(jīng)24小時(shí)溫育后, 細(xì)胞單層用丙酮固定, 用熒光標(biāo)記的抗NP抗體染色, 以檢測(cè)未被中和的病毒的存在(熒光灶FFU)。與病毒對(duì)照組比較, 計(jì)算每種待測(cè)血清使固定量CVS病毒的FFU/ml 減少50% 的稀釋度，然后與已知滴度的參考血清比較，計(jì)算每種待測(cè)血清的中和抗體滴度。快速熒光灶抑制試驗(yàn) 三倍系列稀釋待測(cè)血清 預(yù)先滴定過的中和用狂犬病毒（設(shè)已知國(guó)際單位的標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照） CVS病毒懸液（稀釋成30- 100FFD50） 等量混合 37保溫1小時(shí)后 37中和1小時(shí) 復(fù)滴定TCID50 接種96孔已形成單層的BSR細(xì)胞 CO2

39、孵箱37培養(yǎng)24小時(shí) 固定并用熒光抗體染色，熒光鏡觀察， 記錄每孔熒光灶數(shù)量，計(jì)算血清抗體效價(jià)病毒最適攻擊量的確定： 24小時(shí)能使80%細(xì)胞被感染的最高稀釋度。MNT和RFFIT檢測(cè)RV中和抗體含量的變異范圍： MNT ： 67% 149% RFFIT： 68% 146%MNT和RFFIT檢測(cè)2種抗RV血清參考品的結(jié)果參考品 RFFIT(IU/ml) MNT(IU/ml） A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT） 15.2 16.2 B 40.5 52.2 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3 （GMT） 56.0 50

40、.0微量RFFIT方法的建立 我所在八年前已開始建立起微量RFFIT方法，并對(duì)該方法的重復(fù)性、特異性和靈敏度與MNT進(jìn)行了比較，共檢測(cè)了數(shù)百份人畜血清樣品。該方法有希望在狂犬病的臨床診斷、疫苗質(zhì)量控制和流行病學(xué)調(diào)查等項(xiàng)工作中獲得廣泛應(yīng)用。A. 實(shí)驗(yàn)方法 1) 攻擊病毒的制備和滴定： (1) 通常采用的毒株為固定的狂犬病毒CVS株, 在BHK/BSR細(xì)胞中制備。 (2) 細(xì)胞上清分裝安瓶, 儲(chǔ)存在-80。 (3) 最適攻擊劑量為24小時(shí)溫育后能使80%的細(xì)胞感染(產(chǎn)生熒光包含體)的最高病毒稀釋度(預(yù)試驗(yàn)確定，參見前述組織培養(yǎng)狂犬病毒快速滴定法)。2) 血清病毒中和反應(yīng)： (1) 待檢血清經(jīng)56

41、30分鐘滅活。 (2) 在96 孔板上設(shè)置 “未感染細(xì)胞對(duì)照” 和 “病毒對(duì)照”孔。 (3) 每個(gè)血清稀釋度設(shè)2個(gè)孔。 (4) 除病毒對(duì)照孔外, 每個(gè)孔加入100l D-MEM 培養(yǎng)基。 (5) 直接在孔中進(jìn)行待檢血清和參考血清的系列3倍稀釋: (每孔已加入100l 培養(yǎng)基) 將50l血清加入第一排孔, 依次從1/3 到1/81 稀釋。在 “病毒對(duì)照” 孔, 加入100l培養(yǎng)基。 (6) 在含稀釋血清的每個(gè)孔內(nèi), 加入50l預(yù)先滴定的病毒懸液。 在 “未感染細(xì)胞對(duì)照” 孔內(nèi), 加入50l培養(yǎng)基。 在“病毒對(duì)照孔”, 對(duì)病毒懸液進(jìn)行4次2倍稀釋, 從1/2 到1/16。 (7) 在375%恒濕溫

42、箱中保溫1小時(shí)。3) 加入細(xì)胞： (1) 用胰酶消化細(xì)胞, 制備濃度為1x106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液. 每孔加入50l細(xì)胞懸液(5x104 細(xì)胞)。 (2) 在375% CO2 恒濕溫箱中溫育24小時(shí)。 4) 固定和染色： (1) 用與盛有漂白粉溶液的大瓶相連的真空裝置抽吸去各孔中的上清液。 (2) 用PBS 浸泡各孔3次, 每次5分鐘(抽吸上清液)。 (3) 以80% 丙酮浸洗各孔, 重復(fù)一次(在-20C放置5分鐘)。抽干各孔, 空氣干燥。 (4) 每孔加入40l抗NP 抗體熒光結(jié)合物( 預(yù)先1:20) 稀釋), 在37C 濕盒中保溫30 分鐘。 (5) 吸出結(jié)合物, 以PBS 洗2次，第一

43、次1分鐘, 第二次5分鐘。 (6) 空氣干燥, 每孔加1 滴甘油。 (7) 螢光顯微鏡下觀察。 B. 結(jié)果觀察 1) 記錄每孔的螢光數(shù)(FF)。 2) 與病毒對(duì)照組比較, 對(duì)每種待測(cè)血清計(jì)算FF數(shù)減少50% 的稀釋度。 3) 與參考血清比較, 計(jì)算每種待測(cè)血清的滴度。 C. 計(jì)算實(shí)例: 血清X 1/27: 15% 參考血清: 10 IU/ml 1/81: 20% 1/81: 60% 1/243: 70% (50-15)/(60-15)xLog3+Log 27 (50-20)/(70-20)xLog3+Log 81 =0.371+1.4314=1.80 =0.286+1.9=2.194 101.

44、8=63 102.194=156.5 X / 10 = 63 / 156.5 X=4.03 IU /ml用MNT和RFFIT測(cè)定2種抗RV中和血清參考品的結(jié)果 參考品 RFFIT(IU/ml) MNT(IU/ml） A 13.4 14.0 20.2 19.5 12.7 13.9 15.5 18.0（GMT） 15.2 16.2 B 40.5 52.2 70.0 42.2 52.3 60.0 66.2 47.3 （GMT） 56.0 50.0RFFIT的特點(diǎn)： 可定量檢測(cè)狂犬病毒中和抗體效價(jià)。 耗時(shí)較短，可用于精確定量的快速診斷。 重復(fù)性好。 需專門技術(shù)培訓(xùn)，操作較繁瑣。 需熒光顯微鏡。3. 酶

45、免疫吸附法（ELISA）： 酶免疫吸附法是七十年代建立的方法，目前世界上用于檢測(cè)狂犬病毒抗體的酶免疫法基本上是采用間接ELISA法，其吸附抗原有全病毒顆粒、純化的狂犬病毒糖蛋白以及純化的狂犬病毒核衣殼蛋白（RNP），并以過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體作為標(biāo)記抗體，即可檢測(cè)人及不同動(dòng)物血清中的抗狂犬病毒抗體。 各種檢測(cè)狂犬病毒抗體的ELISA法的抗原抗體比較酶免疫吸附法吸附抗原所檢測(cè)的抗體間接ELISA純化狂犬病毒糖蛋白抗 狂 犬 病 毒 糖 蛋 白 抗 體（中和抗體）間接ELISA純化全病毒顆粒抗狂犬病毒抗體（含中和抗體）間接ELISA粗制狂犬病毒抗吸附抗原的抗體（含中和抗體）間接ELISA純化狂犬病

46、毒核衣殼蛋白抗狂犬病毒核衣殼蛋白夾 心 間 接ELISA狂犬病毒抗原抗狂犬病毒抗原抗體（含中和抗體） 酶免疫吸附法 抗狂犬病毒單抗包被 狂犬病毒抗原待檢人血清中的抗狂犬病毒抗體酶標(biāo)抗人IgG抗體顯色底物ELISA的特點(diǎn)： ELISA只需簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，尤其適合檢測(cè)大量的血清樣品，且在很短的時(shí)間內(nèi)即可出結(jié)果。 ELISA法與MNT有較好的相關(guān)性，在小鼠飼養(yǎng)及組織培養(yǎng)不具備的實(shí)驗(yàn)室里，ELISA可視為MNT的替代方法。 嚴(yán)格地講，ELISA實(shí)驗(yàn)并沒有測(cè)定真正的中和抗體，所測(cè)抗體為幾乎所有的與包被板上抗原結(jié)合的IgG抗體，包括一些非特異性抗體，所以其結(jié)果不用國(guó)際單位（IU/ml）表示，而是用等價(jià)單

47、位（EU/ml）表示。EIA檢測(cè)維爾博疫苗首劑注射后抗體陽檢率EIA檢測(cè)維爾博疫苗首劑注射后抗體陽檢率0 00.20.20.40.40.60.60.80.81 11.21.20 07 71414282845459090天抗體陽檢率維爾博維爾博 EIA與MNA檢測(cè)狂犬病毒抗體結(jié)果比較免疫用疫苗 例數(shù) MNA EIA EIA 陽性數(shù) 陽性數(shù) 陽檢率 維爾博苗 74 74 74 100%aG濃縮苗 67 67 62 92.5%CTN精制苗 34 / 31 / 4.其他檢測(cè)抗體的方法： 1） 斑點(diǎn)免疫結(jié)合法（DIA）： 1986年由Heberling等建立，用于檢測(cè)人血清中狂犬病毒抗體，其結(jié)果與RFF

48、IT具有可比性，但須稍作改進(jìn)以檢測(cè)狂犬病毒中和抗體水平。該方法只需一滴血、僅30-40分鐘即可出結(jié)果。2） 快速凝集法（RAT）： 以抗原致敏乳膠，可檢測(cè)2.5IU/ml以上的抗體水平, RAT與MNT符合率達(dá)97%以上。3） 間接免疫熒光法（IFA）： 以狂犬病毒感染細(xì)胞，制成細(xì)胞片，用間接免疫熒光法檢測(cè)人血清中狂犬病毒抗體，但該方法只能作半定量測(cè)定抗狂犬病毒抗體，其靈敏度隨待測(cè)血清的稀釋度增加而降低，同時(shí)與細(xì)胞片制備過程中病毒接種的量及感染時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。 各血清學(xué)試驗(yàn)獲得結(jié)果所需時(shí)間 方法 MNTRFFITELISA IFA 時(shí)間21天26小時(shí) 4小時(shí) 2小時(shí) 定性或定量定量定量定量 定性

49、六實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)：盡量少用或不用動(dòng)物 RV的傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是小鼠動(dòng)物試驗(yàn)。在中國(guó)生物制品規(guī)程2000年版中，規(guī)定的狂犬病疫苗的多項(xiàng)檢定均采用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，如病毒滴定、病毒滅活確證試驗(yàn)以及疫苗效力測(cè)定等。 這些實(shí)驗(yàn)都需要大量動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高，操作繁瑣，而且每次實(shí)驗(yàn)需時(shí)14天以上，其中測(cè)定疫苗效力的實(shí)驗(yàn)甚至需要至少28天。 由于影響動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，如動(dòng)物的品系、飼養(yǎng)條件，實(shí)驗(yàn)人員的操作水平等，所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差較大、重復(fù)性較低。細(xì)胞培養(yǎng)法相對(duì)于小鼠動(dòng)物試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn) 廉價(jià)：一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔可取代一組小鼠，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用可顯著降低。快速：全部實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間能降至2個(gè)工作日。簡(jiǎn)便、重復(fù)性高：由于細(xì)

50、胞培養(yǎng)是在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的無菌條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)條件規(guī)范，各種試劑定量的精確性能得到保證，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作水平的要求較易滿足，因而所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果有更高的一致性。 靈敏度：與小鼠動(dòng)物試驗(yàn)基本相同。避免使用動(dòng)物。 在歐洲藥典2000年版中，相應(yīng)的檢定絕大多數(shù)均由細(xì)胞培養(yǎng)法所取代。 保護(hù)動(dòng)物、善待動(dòng)物 采用細(xì)胞培養(yǎng)取代小鼠動(dòng)物試驗(yàn)，也符合保護(hù)動(dòng)物這一國(guó)際流行趨勢(shì)。保護(hù)動(dòng)物、善待動(dòng)物是一個(gè)國(guó)家或社會(huì)文明進(jìn)步程度的標(biāo)志之一。許多發(fā)達(dá)國(guó)家都已有明確的有關(guān)保護(hù)動(dòng)物的立法，例如在歐洲已頒布 保護(hù)用于科學(xué)和其它試驗(yàn)?zāi)康牡募棺祫?dòng)物公約 要求在同時(shí)有其它實(shí)驗(yàn)方法可用時(shí)，盡量不用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；在沒有其他替代方法時(shí)，也應(yīng)盡量減少動(dòng)物的用量。隨著中國(guó)改革開放的深入，我國(guó)在科研動(dòng)物的使用方面也應(yīng)逐步與國(guó)際接軌，今后盡量減少動(dòng)物用量已是大勢(shì)所趨。 在我國(guó)推廣應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)法