PD1PDL1信號通路阻斷劑的研究PPT課件

1、PD1PDL1信號通路阻斷劑的研究1.前言2.立題依據(jù)和意義6. 已有進展5. 進度安排 4. 研究設(shè)想及方法開題報告開題報告 3. 國內(nèi)外研究進展2前言o腫瘤逃逸是目前腫瘤免疫治療公認(rèn)的障礙?；颊吣[瘤細(xì)胞自身的缺陷和免疫系統(tǒng)的功能障礙一起作用促進了腫瘤的瘋狂生長。T細(xì)胞在免疫治療腫瘤的過程中處于中心地位，如果能調(diào)動體內(nèi)的殺傷武器，那將是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。o腫瘤的免疫逃逸機制與機體對腫瘤的免疫應(yīng)答之間存在著極為復(fù)雜的關(guān)系。腫瘤免疫治療的過程中早期腫瘤特異性的CD8+T細(xì)胞是激活的，隨著腫瘤生長到后期失去了殺傷的功能；IFN-r的分泌功能持續(xù)增強，腫瘤產(chǎn)生抵抗力。總而言之，無論

2、是通過調(diào)節(jié)因子還是免疫細(xì)胞的修飾都是為了極大限度的提高病人自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。不但要在體內(nèi)激活原有自身的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，還要讓已經(jīng)調(diào)動的反應(yīng)持續(xù)增強才是免疫治療腫瘤的策略。oT細(xì)胞的活化除了需要通過APC遞呈MHC-抗原肽給抗原特異性T細(xì)胞提供第一信號外，還需要一系列協(xié)同刺激分子提供第二信號，進而才能使T細(xì)胞達(dá)到生理活化閾值產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答，這在理論上更好地解釋了免疫系統(tǒng)對自身和非自身抗原產(chǎn)生免疫學(xué)應(yīng)答時精確而微妙的調(diào)節(jié)機制。如果缺少共刺激分子提供的第二信號，將會導(dǎo)致T細(xì)胞的無反應(yīng)性或特異性免疫耐受甚至進入凋亡，因此，正性和負(fù)性協(xié)同刺激信號的調(diào)節(jié)及兩者之間的平衡在極體免疫應(yīng)答的整個過程中起著重

3、要的調(diào)節(jié)作用。3立題依據(jù)及意義oPD-L1(B7-H1)屬于B7家族，具有IgV和IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)及胞漿區(qū)尾部，PD-L1與其T細(xì)胞上的受體PD1相互作用，在免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用；該分子具有廣泛的組織表達(dá)譜，在一些腫瘤細(xì)胞系上有較高的表達(dá)，許多研究均表明其與腫瘤的免疫逃逸機制相關(guān)。腫瘤部位的微環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上的PD-L1的表達(dá)，且表達(dá)廣泛，表達(dá)的PD-L1有利于腫瘤的發(fā)生和生長，誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞的凋亡。轉(zhuǎn)染PD-L1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內(nèi)后具有更強的致瘤性和侵襲性。這些生物學(xué)特性均可通過阻斷PD-L1而逆轉(zhuǎn)。敲除PD1基因

4、的小鼠，阻斷PD-L1/PD-1通路，則接種腫瘤細(xì)胞不能形成腫瘤。o通過阻斷PD-L1/PD-1信號通路可有效抑制腫瘤生長，可根據(jù)此設(shè)計新的對腫瘤免疫逃逸的治療方案，來加強T細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用。4國內(nèi)外研究進展-PDL1在腫瘤中的表達(dá)oPD1（programmed death-1）最初是在凋亡的T細(xì)胞雜交瘤中得到的，由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)而被命名為程序性死亡-1受體。o目前，PD-1的配體被證實有兩個，分別是PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC).PD-L1蛋白廣泛表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞（APCs）、活化T、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層、心肌內(nèi)皮和胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞。在許多人類腫瘤組織中

5、均可檢測到PD-L1蛋白的表達(dá)，且許多癌組織較正常組織中的PD-L1表達(dá)水平明顯上調(diào)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，已先后在乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到PD-L1蛋白的表達(dá)，且PDL1的表達(dá)水平和患者的臨床及預(yù)后緊密相關(guān)。5國內(nèi)外研究進展-PD1/PDL1在腫瘤免疫治療中的作用o在抗腫瘤免疫中，通常遵循腫瘤特異性T細(xì)胞活化、T細(xì)胞增值、腫瘤浸潤和T細(xì)胞記憶應(yīng)答加強的步驟。研究表明，腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的APCs表達(dá)的PD-L1均可經(jīng)PD-1/PD-L1信號通路抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的活化，下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫

6、應(yīng)答。因此，干預(yù)PD-1/PD-L1信號有望成為腫瘤免疫治療的新策略。oPD-L1單抗能有效抑制局部腫瘤生長；o阻斷PD-1/PD-L1信號可以促進腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的增值，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；o阻斷腫瘤細(xì)胞上相關(guān)PD-L1信號可上調(diào)浸潤CD8T細(xì)胞IFN-R的分泌，表明PD-1/PD-L1信號通路的阻斷在以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答為目的的腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用；o選擇抗PD-L1單抗配合腫瘤疫苗進行腫瘤免疫治療可有效加強腫瘤疫苗的免疫激活作用，減弱腫瘤微環(huán)境對療效的影響；6研究設(shè)想及方法7研究設(shè)想及方法o 表達(dá)可溶性PD1與腫瘤細(xì)胞上過度表達(dá)的PDL1結(jié)合；o 利用單鏈抗體庫篩選與PDL1特異性結(jié)

7、合的SCFV；o 利用多肽庫篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽；o SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理的研究；8PD-L1/PD-1相關(guān)蛋白的表達(dá)鑒定o已有報道PD-1和PD-L1在原核中以包涵體形式表達(dá)，為了獲得可溶性的PD-1和PD-L1；我們擬采用sumo標(biāo)簽融合表達(dá)PD-1和PD-L1，以期獲得可溶性表達(dá)；鎳柱純化，sumo酶酶切，再鎳柱純化獲得與天然氨基酸相同的PD-1和PD-L1；以備單鏈抗體及多肽的篩選實驗；o采用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)純化PD1-IgG，來阻斷PD-1/PD-L1通路；9PDL1的單鏈抗體SCFV的篩選o利用噬菌體展示技術(shù)從高容量半合成人抗體文庫中篩選PDL1的

8、特異性的且具有封閉PDL1生物學(xué)活性的單鏈抗體片斷(scFv)；o采用酵母表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)純化SCFV-FC，來研究是否能阻斷PD-1/PD-L1通路；o利用SCFV與PDL1的高親和力，研究能否融合毒素靶向殺傷高表達(dá)PDL1蛋白的腫瘤細(xì)胞；10PDL1特異性結(jié)合多肽的篩選o利用NEB 7/12-mer多肽文庫；篩選與PDL1特異性結(jié)合的多肽；研究其與PDL1的結(jié)合能力，能否與其受體PD1競爭性結(jié)合的能力；能否成開發(fā)成為一種阻斷PD1/PDL1信號通路的多肽藥物；11SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理的研究oT細(xì)胞活力的增強：流式細(xì)胞儀檢測活化狀態(tài)T細(xì)胞(CD44+)的數(shù)量是否增加；o細(xì)

9、胞因子數(shù)量的增加：ELISA檢測IFN-r、IL-10等細(xì)胞因子的表達(dá)量是否提高；o腫瘤位置T細(xì)胞數(shù)目的增加：免疫組化方法檢測活化T細(xì)胞是否在腫瘤位置聚集以發(fā)揮其殺傷作用；12進度安排o研究生一年級上學(xué)期：專業(yè)課的理論學(xué)習(xí)；o研究生一年級下學(xué)期：閱讀大量的專業(yè)文獻，獲取PD1/PDL1基因；o研究生二年級上學(xué)期 ：完成PD1、PDL1及相關(guān)基因的蛋白表達(dá)純化鑒定 ；o研究生二年級下學(xué)期：完成PDL1結(jié)合SCFV及多肽的篩選工作，并對其活性進行初步的鑒定；o研究生三年級上學(xué)期 ：完成SCFV或多肽阻斷PD1/PDL1通路機理的研究；o研究生三年級下學(xué)期 ：撰寫畢業(yè)論文，準(zhǔn)備答辯。13已有進展-PD1表達(dá)Fig.1. SDS-PAGE of SUMO-PD1 expression Lane 1: uninducedLane 2: induced by IPTG (colony 1)Lane 3: induced by IPTG (colony 2)Lane M: protein MarkerNote: Red arrow indicated the target protein14已有進展-PDL1表達(dá)Fig.2. SDS-PAGE of SUMO-PDL1 expressio