化學發(fā)光免疫技術

1、人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社免疫學檢驗免疫學檢驗人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第二十一章第二十一章化學發(fā)光免疫技術化學發(fā)光免疫技術 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.化學發(fā)光劑的概念及常用的化學發(fā)光劑。化學發(fā)光劑的概念及常用的化學發(fā)光劑。2.2.化學發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術類化學發(fā)光免疫分析的基本原理及其技術類型。型。3.3.化學發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技化學發(fā)光酶免疫分析基本原理及其分離技術。術。4.4.電化學發(fā)光免疫分析基本原理。電化學發(fā)光免疫分析基本原理。5.5.化學發(fā)光免疫技術的臨床應用。化學發(fā)光免疫技術的臨床應用。本章要點本章要點人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社目錄目錄 發(fā)光

2、基本知識發(fā)光基本知識1化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析2化學發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析3電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析4化學發(fā)光免疫技術的臨床應用化學發(fā)光免疫技術的臨床應用5人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 化學發(fā)光免疫化學發(fā)光免疫技術技術是將具有高靈敏度的化學發(fā)光是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的測定技術與高特異性的抗原抗體抗原抗體反應反應技術技術相結(jié)合，相結(jié)合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、維生素和藥物等的檢測分析技術素和藥物等的檢測分析技術。該技術具有。該技術具有特異性特異性高、高、靈敏度靈敏度高、分離簡便、高、分離簡

3、便、 快速、試劑無毒、安快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、可自動化全穩(wěn)定、可自動化分析等特點，在免疫學檢驗中分析等特點，在免疫學檢驗中應用廣泛。應用廣泛。 前前 言言人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社放放射射免免疫疫技技術術酶酶免免疫疫技技術術熒熒光光免免疫疫技技術術金金免免疫疫技技術術化化學學發(fā)發(fā)光光免免疫疫技技術術標記免疫技術標記免疫技術人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第一節(jié)第一節(jié) 基本知識基本知識 一、發(fā)光一、發(fā)光發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由低能級的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，的基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)，然后再返回到基態(tài)，釋放出的能

4、量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)的激發(fā)能不同可將發(fā)光分為發(fā)能不同可將發(fā)光分為光照發(fā)光光照發(fā)光、生物發(fā)光生物發(fā)光和和化學發(fā)化學發(fā)光光。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.光照發(fā)光（光照發(fā)光（photoluminescencephotoluminescence） 發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長入射光照射后進入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的入激發(fā)態(tài)，當回復至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光?？梢姽?。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社2.2.生物發(fā)光（生物發(fā)光（bioluminescencebioluminescence） 發(fā)生在

5、生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用用ATPATP產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復產(chǎn)能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來?；鶓B(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社3.3.化學發(fā)光化學發(fā)光 某些物質(zhì)某些物質(zhì)( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )在化學反應時，吸收了反應過在化學反應時，吸收了反應過程中所產(chǎn)生的化學能，使反應的產(chǎn)物分子或中間程中所產(chǎn)生的化學能，使反應的產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電

6、子從激發(fā)態(tài)態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 一個化學反應要產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以一個化學反應要產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象，必須滿足以下條件：下條件：該反應必須提供足夠的激發(fā)能該反應必須提供足夠的激發(fā)能, , 并由某一步驟單并由某一步驟單獨提供獨提供, , 因為前一步反應釋放的能量將因振動弛豫因為前一步反應釋放的能量將因振動弛豫消失在溶液中而不能發(fā)光消失在溶液中而不能發(fā)光要有有利的反應過程要有有利的反應過程, , 使化學反應的能量至少

7、能被使化學反應的能量至少能被一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)一種物質(zhì)所接受并生成激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學發(fā)光量子效率釋放激發(fā)態(tài)分子必須具有一定的化學發(fā)光量子效率釋放出光子出光子, , 或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子使之進或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量給另一個分子使之進入激發(fā)態(tài)并釋放出光子入激發(fā)態(tài)并釋放出光子 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光在化學發(fā)光反應中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物稱為子的形式釋放能量的化合物稱為化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑或或發(fā)發(fā)光底物光底物。二二. .化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 作為化學發(fā)光免疫技術的

8、化學發(fā)光劑應符合以下作為化學發(fā)光免疫技術的化學發(fā)光劑應符合以下幾個條件：幾個條件： 發(fā)光的量子產(chǎn)率高發(fā)光的量子產(chǎn)率高 物理物理- -化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配化學特性要與被標記或測定的物質(zhì)相匹配 能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物 其化學發(fā)光常是氧化反應的結(jié)果其化學發(fā)光常是氧化反應的結(jié)果 在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 常用的化學發(fā)光劑或發(fā)光底物有常用的化學發(fā)光劑或發(fā)光底物有 1.1.直接化學發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑 2.2.酶促反應的發(fā)光底物酶促反應的發(fā)光底物 3.3.電化學發(fā)光劑

9、電化學發(fā)光劑 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.直接化學發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑 在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，它們在化學結(jié)構上有產(chǎn)生發(fā)光的參與發(fā)光反應，它們在化學結(jié)構上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖特有基團，可直接標記抗原或抗體。如常用的吖啶酯（啶酯（acridiniumacridinium，AEAE） 。人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社吖啶酯吖啶酯在堿性條件下被在堿性條件下被H H2 2O O2 2氧化時氧化時, ,發(fā)出波長發(fā)出波長為為470nm470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)的光，具有很高的發(fā)

10、光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物態(tài)產(chǎn)物N-N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社2.2.酶促反應的發(fā)光底物酶促反應的發(fā)光底物 是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。光。 目前化學發(fā)光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧目前化學發(fā)光酶免疫技術中常用的酶有辣根過氧 化物酶（化物酶（HRPHRP）和堿性磷酸酶（）和堿性磷酸酶（ALPALP）。）。HRPHRP的常用的常用 的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，的發(fā)光底物為魯米諾或其衍生物，ALPALP的發(fā)光底物的發(fā)光底物 為金剛烷（為金剛烷（AMPPDAMPP

11、D） 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社（1 1）魯米諾或其衍生物）魯米諾或其衍生物 魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化魯米諾在堿性條件下可被一些氧化劑氧化，發(fā)生化學發(fā)光反應，輻射出最大發(fā)射波長為學發(fā)光反應，輻射出最大發(fā)射波長為425nm425nm的光。的光。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 魯米諾增強發(fā)光反應原理魯米諾增強發(fā)光反應原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社（2 2）AMPPDAMPPD 3-(23-(2- -螺旋金剛烷螺旋金剛烷)-4-)-4-甲氧基甲氧基-4-(3-4-(3“- -磷酰氧基磷酰氧基) )苯苯-1,2-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二氧雜環(huán)丁烷人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社3 3

12、電化學發(fā)光劑電化學發(fā)光劑 電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應而發(fā)光的物質(zhì)。如化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕應而發(fā)光的物質(zhì)。如化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+Ru(bpy)32+和電子供體三丙胺（和電子供體三丙胺（TPATPA）在陽性電）在陽性電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 用化學發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體用化學發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標記抗體( (抗原抗原) )，與待測標本中相應的抗原與待測標本中相應的抗原( (抗體抗體) )和磁顆粒性的抗和磁顆粒性的抗體（抗原

13、）發(fā)生免疫反應后，通過磁場把結(jié)合狀體（抗原）發(fā)生免疫反應后，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，這態(tài)和游離狀態(tài)的化學發(fā)光劑標記物分離開來，這時只需加入氧化劑（時只需加入氧化劑（H H2 2O O2 2）和）和NaOHNaOH使成堿性環(huán)境，使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原生的光子能，可從標準曲線上計算出待測抗原( (抗體抗體) )的含量的含量 第二節(jié)第二節(jié) 化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析

14、一、一、 檢測原理檢測原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術，即用抗原或抗體包被磁顆粒，常用磁顆粒分離技術，即用抗原或抗體包被磁顆粒，與標本中相應抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或與標本中相應抗體或抗原及吖啶酯標記的抗體或抗原通過一定模式的免疫學反應后抗原通過一定模式的免疫學反應后, ,最終通過在磁場最終通過在磁場中沖洗將結(jié)合到免疫復合物中的標記物和游離標記物中沖洗將結(jié)合到免疫復合物中的標記物和游離標記物進行分離的技術。進行分離的技術。 二、方法類型二、方

15、法類型 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社2.2.常用的免疫學反應模式常用的免疫學反應模式 雙抗原夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法固相抗原競爭法雙抗體夾心法雙抗體夾心法人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、技術要點三、技術要點抗原抗體結(jié)合反應抗原抗體結(jié)合反應 結(jié)合物與游離物的分離結(jié)合物與游離物的分離 (磁顆粒分離技術磁顆粒分離技術)化學發(fā)光反應化學發(fā)光反應 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 化學發(fā)光酶免疫分析（化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIACLEIA）是用參與催化某一）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRPHRP）或堿）或堿性磷酸酶性磷酸酶(ALP)(ALP

16、)來標記抗原或抗體，在與待測標本來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗體中相應的抗體( (抗原抗原) )發(fā)生免疫反應后，經(jīng)洗滌將發(fā)生免疫反應后，經(jīng)洗滌將結(jié)合物與游離的酶標物分離后，加入底物結(jié)合物與游離的酶標物分離后，加入底物( (發(fā)光劑發(fā)光劑) )，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑攀眨怆姳对龉軐⒐庑盘栟D(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算大，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。出測定物的濃度。第三節(jié)第三節(jié) 化學發(fā)光酶免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析一、一、 檢測原

17、理檢測原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社堿性磷酸酶化學發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖堿性磷酸酶化學發(fā)光酶免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 1.1.根據(jù)標記酶不同分類根據(jù)標記酶不同分類 可分為辣根過氧化物可分為辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析和堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或記的化學發(fā)光酶免疫分析。前者常以魯米諾或其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以其衍生物作為發(fā)光底物，后者常以AMPPDAMPPD作為發(fā)作為發(fā)光底物。光底物。 2. 2. 根據(jù)免疫學反應模式分類根據(jù)免疫學反應模式分類 同化學發(fā)光免同化學發(fā)

18、光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是相和固相抗原競爭法等主要模式，所不同只是相應抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)應抗原或抗體上標記的是酶而不是直接標記發(fā)光劑。光劑。 二、方法類型二、方法類型 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、技術要點三、技術要點抗原抗體結(jié)合反應抗原抗體結(jié)合反應 結(jié)合物與游離物的分離結(jié)合物與游離物的分離 （磁顆粒分離法磁顆粒分離法 、微粒子捕獲法、微粒子捕獲法 、包被聚苯乙烯反應珠或孔分離法、包被聚苯乙烯反應珠或孔分離法 ）酶促發(fā)光反應酶促發(fā)光反應 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社 電化學發(fā)光

19、免疫分析（電化學發(fā)光免疫分析（ECLIAECLIA）是以電化學發(fā)光劑）是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體三聯(lián)吡啶釕標記抗體( (抗原抗原) )，通過抗原抗體反應，通過抗原抗體反應和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出和磁珠分離技術，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它的光強度對待測的抗原或抗體進行定量分析，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。 第四節(jié)第四節(jié) 電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光免疫分析一、一、 檢測原理檢測原理人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社電化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖電化學發(fā)光免疫分析雙抗體夾心法原理示意圖 人民衛(wèi)

20、生出版社人民衛(wèi)生出版社電化學發(fā)光免疫測定示意圖電化學發(fā)光免疫測定示意圖人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.分離方法分離方法 常用磁顆粒分離技術常用磁顆粒分離技術2.2.免疫學反應模式免疫學反應模式 其反應模式同發(fā)光免疫分析，其反應模式同發(fā)光免疫分析，主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原主要有雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和固相抗原競爭法三種主要模式，所不同只是相應抗原或抗競爭法三種主要模式，所不同只是相應抗原或抗體上標記的是三聯(lián)吡啶釕。體上標記的是三聯(lián)吡啶釕。 二、方法類型二、方法類型 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社三、技術要點三、技術要點抗原抗體反應抗原抗體反應 結(jié)合物與游離物的分離結(jié)合物與

21、游離物的分離(磁顆粒分離技術磁顆粒分離技術)電化學發(fā)光過程電化學發(fā)光過程 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社第五節(jié)第五節(jié) 化學發(fā)光免疫技術的臨床應用化學發(fā)光免疫技術的臨床應用一、化學發(fā)光免疫技術的特點一、化學發(fā)光免疫技術的特點1.1.敏感度高，甚至超過敏感度高，甚至超過RIARIA；2.2.精密度和準確性均可與精密度和準確性均可與RIARIA相比；相比；3.3.試劑穩(wěn)定，無毒害；試劑穩(wěn)定，無毒害；4.4.測定耗時短；測定耗時短；5.5.測定項目多；測定項目多；6.6.已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)。已發(fā)展成自動化測定系統(tǒng)。 人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社1.1.甲狀腺激素甲狀腺激素 T3T3、T4T4、hTS

22、HhTSH、FT4FT4、FT3FT3、抗、抗TPOTPO、甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。甲狀腺球蛋白、抗甲狀腺球蛋白抗體等。2.2.生殖激素生殖激素 -HCG-HCG、催乳素、促卵泡激素、促黃、催乳素、促卵泡激素、促黃體激素、孕酮、雌二醇、非結(jié)合雌三醇、甲胎蛋白、體激素、孕酮、雌二醇、非結(jié)合雌三醇、甲胎蛋白、睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。睪丸酮、硫酸脫氫異雄酮。3.3.腎上腺腎上腺/ /垂體激素垂體激素 皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、人生長激皮質(zhì)醇、尿皮質(zhì)醇、人生長激素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素。素、甲狀旁腺素、促腎上腺皮質(zhì)激素。二、二、 化學發(fā)光免疫技術常見的檢測項目化學發(fā)光免疫技術常見的檢測項目

23、人民衛(wèi)生出版社人民衛(wèi)生出版社4.4.貧血因子貧血因子 維生素維生素B12B12、葉酸、紅細胞葉酸、鐵、葉酸、紅細胞葉酸、鐵蛋蛋白等。白等。5.5.腫瘤標記物腫瘤標記物 AFPAFP、CEACEA、PSAPSA、游離、游離PSAPSA、CAl9-9CAl9-9、CAl25CAl25、CAl5-3CAl5-3等。等。6 6感染性疾病感染性疾病 衣原體抗原、尿衣原體抗原、衣原衣原體抗原、尿衣原體抗原、衣原體抗原確認、弓形體體抗原確認、弓形體IgGIgG抗體、弓形體抗體、弓形體IgMIgM抗體、風抗體、風疹病毒疹病毒IgGIgG抗體、風疹病毒抗體、風疹病毒IgMIgM抗體、巨細胞病毒抗體、巨細胞病毒IgGIgG抗體、巨細胞病毒抗體、巨細胞病毒IgMIgM抗體等?？?/p>